杜东颖，盛东北，霍环艳，段佳蕾，王孟月，谭镜明，陈宇明，胡鹏辉，刘武杰，田克恭
（1.国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳 471000；
2.长沙市农业综合行政执法局，长沙 410205）
鸡肝炎-心包积液综合征（hepatiti shydropericardium syndrome, HHS）是由血清4型禽腺病毒（Flow adenovirus serotype 4, FAdV-4）引起的高致病性传染病[1]，该病首次在巴基斯坦的安卡拉地区发生，随后陆续在美国、印度、韩国等地区流行[2-5]，HHS可感染不同品种的鸡，临床剖检特征性病变主要包括心包积液，肝脏肿大、颜色变浅等[6-8]。
FAdV-4是无囊膜的双链DNA病毒，基因全长约45 kb，病毒粒子为二十四面体结构，包括3种主要结构蛋白[9-10]，分别是六邻体（Hexon）蛋白、五邻体（Penton）基座、纤突蛋白（Fiber），作为基座的Penton蛋白通过非共价键与Hexon和Fiber相接。研究证实FAdV-4含两个Fiber阅读框，分别编码Fiber-1和Fiber-2蛋白，其中Fiber-2蛋白在病毒的入侵、增殖、组装和释放过程中发挥重要作用[11]，同时该蛋白可刺激机体产生中和抗体，从而诱导机体产生较强的免疫反应[12]。
近年来，多地区陆续爆发HHS[13-14]，FAdV-4作为我国优势流行血清型[15]，具有较强的致病力，鸡感染后死亡率达30%～90%，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。目前对于禽腺病毒的预防主要以弱毒活疫苗和全病毒灭活疫苗为主，实际应用中，活苗的使用存在一定的毒力返强风险；
全病毒灭活苗的制备工艺复杂、生产成本高，目前未能得到普遍应用。因此安全、有效、价格低廉的亚单位疫苗被越来越多的应用于临床疾病的防控中[16]。
研究表明，FAdV的Fiber蛋白能够诱导中和抗体反应，是亚单位疫苗最合适的免疫原[17-18]，基于此研究结果，本研究利用原核表达系统对Fiber-2蛋白进行表达、纯化，将纯化后的重组Fiber-2蛋白制备不同抗原含量的亚单位疫苗，进行免疫原性评价。结果表明，以AGP效价为1∶2的Fiber-2蛋白制备亚单位疫苗即可刺激机体产生较好的免疫应答，同时可为免疫鸡提供100%的FAdV-4强毒攻击保护。本研究为制备安全、有效的Fiber-2蛋白亚单位疫苗提供了理论依据、奠定了坚实基础。
1.1 主要试剂Q5®High-Fidelity DNA聚合酶、限制性核酸内切酶HindⅢ、NdeI及T4 DNA连接酶均购自美国New England Biolabs公司；
DNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根生化（北京）科技有限公司；
异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-DThiogalactoside, IPTG）诱导剂、预染蛋白marker购自北京索莱宝科技有限公司；
DL2000 DNA marker、DL15000 DNA marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；
辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY二抗购自北京百奥莱博科技有限公司；
Ni Sepharose 6 Fast Flow购自美国General Electric Company；
商品化禽腺病毒Ⅰ群（FADV-I）抗体ELISA试剂盒购自荷兰BioChek公司。
1.2 疫苗、毒株与实验动物Ⅰ群禽腺病毒（4型）灭活疫苗（病毒液灭活前病毒含量为107.0TCID50/0.1 mL）、Ⅰ群FAdV-4 FAV-HN株C3代毒种、Ⅰ群FAdV-4 AGP抗原、Ⅰ群FAdV-4阳性血清均由国家兽用药品工程技术研究中心鉴定、制备与保存；
SPF鸡购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。
1.3 重组质粒pET-30a-Fiber-2的构建按照病毒DNA提取试剂盒说明书，提取FAV-HN株D N A。参考公布的I群禽腺病毒（4型）F i b e r-2蛋白基因序列（G e n B a n k登录号：NC_015323.1），利用Prime Premier 5.0软件设计一对PCR扩增引物，即Fiber-2-F（5"-3"）：ATTCCATATGATGCTCCGGGCCCCTAAAAG（下划线序列为NdeⅠ）；
Fiber-2-R（5"-3"）：CCCAAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCGCTGG（下划线序列HindⅢ），目的片段大小为1440 bp。
以提取的病毒DNA为模板，使用Q5®High-Fidelity DNA聚合酶对Fiber-2蛋白进行PCR扩增，PCR反应体系（50 μL）：2× Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板2 μL，ddH2O 19 μL；
同时设置以ddH2O代替模板的体系作为阴性对照。反应条件：98℃预变性5 min；
98℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；
最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后进行回收。
Fiber-2 PCR回收片段经NdeI、HindⅢ双酶切处理后，经同样双酶切处理的pET-30a通过T4 DNA连接酶进行连接，构建pET-30a-Fiber-2重组表达载体。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过硫酸卡那霉素抗性（硫酸卡那霉素的质量浓度为50 μg/mL）筛选获得单克隆菌落；
挑选单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的克隆，提取质粒进行双酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的质粒进行测序分析。
1.4 重组Fiber-2蛋白的原核表达与纯化将鉴定正确的重组质粒pET-30a-Fiber-2，转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取单菌落至LB液体培养基中（硫酸卡那霉素的质量浓度为50 μg/mL），37℃培养过夜；
将菌液按照1∶100的体积比加至LB液体培养基（硫酸卡那霉素的质量浓度为50 μg/mL）中；
37℃继续培养至菌液OD600值至0.6，加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG进行诱导8 h，同时以不加IPTG作为阴性对照；
对诱导后的菌体进行超声裂解，分别取离心后上清液、沉淀进行12%SDS-PAGE电泳检测，并利用Ⅰ群禽腺病毒（4型）阳性血清对表达重组Fiber-2蛋白进行Western blot鉴定。
利用Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化介质对重组蛋白上清液进行纯化，将收集的洗脱蛋白进行12%SDS-PAGE电泳检测；
纯化后的蛋白液经PBS透析去除咪唑并过滤除菌保存备用。使用Ⅰ群FAdV-4阳性血清对重组蛋白进行定量检测，通过琼脂扩散试验测定Fiber-2蛋白的AGP效价。
1.5 Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性分析
1.5.1 免疫效果评价 为评价Fiber-2蛋白不同抗原含量对SPF鸡的免疫效力，本研究将纯化的重组Fiber-2蛋白液分别稀释至AGP效价为1∶8、1∶4、1∶2、1∶1，按照水相∶油相（1∶2）乳化制备4种不同抗原含量的疫苗，同时以全病毒灭活疫苗作为对照苗；
选取50只健康的21日龄SPF鸡，随机分为5个组，每组10只，分别经皮下接种上述5种疫苗，0.3 mL/只，另设5只SPF鸡接种灭菌生理盐水作为阴性对照。免疫后21 d，采血、分离血清，测定AGP抗体效价。
1.5.2 攻毒保护试验 免疫后21 d，将所有疫苗免疫组和对照组的鸡只，经腿部肌肉注射Ⅰ群FAdV-4 FAVHN株病毒液，每只0.5 mL（含106.5TCID50），观察7 d，记录免疫组鸡和对照鸡的发病和死亡情况，至攻毒后7 d，所有存活鸡剖检，观察大体剖检病变。
2.1 目的基因的扩增以提取的FAV-HN株DNA为模板，对目的基因进行扩增，结果显示，PCR扩增产物约为1440 bp，与预期片段的大小相符（图1）。
图1 FAV-HN株Fiber-2基因扩增结果Fig.1 Amplification result of the FAV-HN strain Fiber-2 gene
2.2 重组质粒pET30a-Fiber-2的酶切鉴定构建好的重组质粒pET30a-Fiber-2用HindⅢ和NdeⅠ双酶切后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，两片段大小分别为1440 bp和5400 bp（图2）。测序结果和BLAST分析表明，pET30a-Fiber-2重组质粒中Fiber-2基因和GenBank中的FAdV-4 Fiber-2基因的核苷酸同源性达99%以上，表明pET30a-Fiber-2重组质粒构建成功。
图2 重组质粒pET30a-Fiber-2的双酶切鉴定Fig.2 Double restriction enzyme identification of recombinant plasmid pET30a-Fiber-2
2.3 重组Fiber-2蛋白的表达与鉴定将菌体裂解后，对离心上清液及沉淀进行12%SDS-PAGE检测；
以未加IPTG诱导的菌体裂解上清和沉淀为阴性对照，诱导后的上清液和沉淀在约57 kDa处出现条带（图3A）；
经Ⅰ群禽腺病毒（4型）阳性血清Western blot分析后，确定重组Fiber-2蛋白成功表达（图3B）。
图3 重组Fiber-2蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant Fiber-2 protein
2.4 重组Fiber-2蛋白的纯化将纯化后收集的洗脱蛋白进行12%SDS-PAGE电泳检测，结果显示，获得纯度约90%的重组Fiber-2蛋白（图4）；
经琼脂扩散试验，测定重组Fiber-2蛋白液的AGP效价为1∶64。
图4 重组Fiber-2蛋白纯化后SDS-PAGE检测Fig4 SDS-PAGE detection of recombinant Fiber-2 protein after purification
2.5 免疫效果评价免疫后21 d，测定5个疫苗免疫组和对照组的血清AGP抗体效价，AGP效价低于1∶1判为阴性。结果显示，当疫苗中抗原含量不低于1∶2（AGP效价）时，免疫组AGP抗体检测均为阳性（10/10），与全病毒灭活疫苗免疫组的AGP抗体阳性率相当（10/10），对照组均为阴性（结果详见表1），表明该亚单位疫苗具有良好的免疫原性。
2.6 攻毒保护试验攻毒保护试验结果显示，对照组鸡于攻毒后第2～3 d开始发病，出现精神沉郁、羽毛蓬乱、不愿走动、嗜睡等临床症状，出现临床症状后1～3 d死亡，死亡鸡剖检可见心包积液、肝脏肿大、出血等病理变化，至攻毒后第7 d，对照组全部死亡。疫苗中Fiber-2蛋白AGP效价抗原含量不低于1∶2的免疫鸡攻毒后全部健活，未出现任何临床症状，攻毒后第7 d剖检，均无异常。当疫苗中Fiber-2蛋白AGP效价抗原含量不低于1∶2时，对SPF鸡的保护率即可达到100%（表1），表明Fiber-2亚单位疫苗可以对SPF鸡产生较好的保护。
表1 不同疫苗组的抗体水平检测结果及攻毒保护结果Table 1 Antibody level test results and challenge protection results of different vaccine groups
2015年7 月起，由FAdV-4引起的HHS给我国养禽业带来严重损失，因此对HHS进行有效的防控尤为重要。在HHS暴发初期，有研究报道将感染鸡肝脏组织研磨、灭活，制备的组织灭活疫苗具有一定的预防效果，但组织苗中含有大量免疫不相关蛋白，并且存在灭活后病毒免疫原性减弱、灭活不彻底等问题；
为了减少HHS传播的风险，细胞培养和SPF鸡胚成为制备灭活苗更为安全的选择，但是这两种方法均需要较高的生产成本且个别毒株在细胞和鸡胚中增殖效价较低，达不到疫苗制备的要求；
后来出现了通过细胞的连续传代，培养出致弱毒株的方法，接种后的鸡能够被完全保护[19]，同样该方法也需要严格的生物安全环境和较高的成本投入。2012年有研究报道，针对心包积液综合征的预防与治疗，与市场上商业化灭活苗相比，通过重组蛋白制备的亚单位疫苗可以为该病提供更好的防控[20]，而且亚单位疫苗生产工艺抗原生产成本低、不存在活疫苗毒力返强，灭活疫苗灭活不彻底、抗原含量不易达标的不足，因此重组蛋白亚单位疫苗有望成为继减毒活疫苗和灭活苗后更理想的新型疫苗。
Schachner等[17]利用杆状病毒表达系统制备基于Fiber-2蛋白的FAdV-4亚单位疫苗，该疫苗可为免疫鸡提供理想的免疫保护效力。但真核表达系统工艺复杂，生产周期长、成本较高。本研究选用大肠杆菌表达系统，获得可溶性的AGP效价不低于1∶64的重组Fiber-2蛋白，工艺简单，生产成本低，制备的亚单位疫苗免疫保护效果理想，适合进行规模化大生产。同时，本研究发现，使用荷兰BioChek商品化的禽腺病毒I群（FADV-I）抗体ELISA试剂盒对Fiber-2蛋白亚单位疫苗和全病毒疫苗免疫血清进行抗体检测时，前者血清抗体值显著低于后者。对造成这种现象的原因进行分析，ELISA试剂盒使用全病毒为包被抗原，FAdV-4病毒粒子中结构蛋白Hexon占比较高，而Fiber-2蛋白极低[21]，因此使用ELISA试剂盒测得的Fiber-2抗体结果较低甚至阴性。因此不能使用全病毒为包被抗原的ELISA试剂盒评价Fiber-2亚单位疫苗免疫血清的抗体效价。
本研究不同抗原含量的Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫攻毒保护试验结果显示，重组Fiber-2蛋白AGP效价为1∶2制备的亚单位疫苗可为免疫鸡提供和全病毒灭活疫苗相当的免疫保护效力，可为免疫鸡提供100%的攻毒保护率。
依托于普莱柯生物股份有限公司的国家兽用药品工程技术研究中心基于重组Fiber-2蛋白开发了一系列Ⅰ群禽腺病毒（4型）单苗和联苗，相关产品正处于注册申报阶段（国家兽药基础信息查询系统），蛋鸡、种鸡、肉鸡临床试验评价效果理想，将为我国禽腺病毒的防控提供技术支撑。同时，也为其他血清型禽腺病毒的防控奠定了技术基础。
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