张 磊，赵腾跃，李 彬
（1.张家口市第二医院神经内科，河北张家口 075000；
2.保定市脑血管病医院神经内科，河北保定 071000）
急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）是脑组织血供突发停止后出现坏死、起病急骤、致死致残率高、治疗后亦会出现较多的后遗症[1]。ACI患者越早治疗，患者并发症及预后越好，因此，ACI患者病情及预后的早期评估对改善患者预后至关重要。自噬相关蛋白Beclin-1是机体自噬调控基因，促进细胞凋亡，细胞自噬是ACI进展过程中的重要一环，其可能参与了脑组织缺血损伤过程[2]。巯基丙酮酸硫基转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST）可促进内源性气体信号分子硫化氢的生成，进而发挥脑保护作用，尤其是脑组织缺血损伤时尤为明显，其在ACI发病时也可能发挥关键作用[3]。凝血酶敏感蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）是机体内黏附蛋白，其可抑制血管性血友病因子的降解，进而促进脑血管血栓形成，其可能与ACI病情进展相关[4]。Beclin-1，3-MST和TSP-1可能与ACI的进展有关，但具体关系尚未明确。因此，本研究探讨Beclin-1，3-MST和TSP-1在ACI患者中的表达及相关性，以期为患者病情及预后的早期评估提供充分的理论依据。
1.1 研究对象 选取2019年6月～2021年6月于张家口市第二医院神经内科就诊的ACI患者150例作为研究组，其中男性97例，女性53例，年龄35～74（52.7±13.5）岁，高血压病68例，糖尿病55例，冠心病43例，同一患者可能并发两种并发症。按脑梗死面积大小分为小面积组（71例）、中面积组（42例）和大面积组（37例），按神经损伤程度分为轻度损伤组（75例）、中度损伤组（38例）和重度损伤组（37例）。纳入标准：①符合“中国急性缺血性脑卒中诊疗指南”中的相关标准[5]；
②初次犯病，入院时发病时间不超过4.5h；
③三个月内无重大手术史；
④三个月内无降脂药物服用、无抗凝、抗血小板药物应用史；
⑤临床资料完整，自愿进入本研究并配合相关检查。排除标准：①并发颅内出血、肿瘤、血管畸形等；
②住院期间颅内感染；
③血液系统、免疫系统疾病；
④严重的心、肝、肾、肺等重要器官功能障碍；
⑤恶性肿瘤；
⑥妊娠及哺乳期女性。另选取100例同期体检健康者作为对照组，其中男性69例，女性31例，年龄34～75（53.8±12.9）岁，与研究组患者的年龄、性别相比差异无统计学意义（均P＞0.05）。入组对象均签署知情同意书，本研究已经获得我院伦理委员会的审批同意。
1.2 仪器与试剂 Beclin-1检测试剂盒（Usbiological公司，美国），3-MST检测试剂盒（武汉优尔生公司），TSP-1检测试剂盒（北京科盈美公司）。
1.3 方法
1.3.1 病情评估：①梗死面积：查阅病例系统中的CT及MRI检查并评估，小面积梗死病灶＜1.5cm，中面积梗死病灶为1.5 cm ～ 3.0 cm，大面积梗死病灶＞3.0 cm且累及两个及以上解剖部位[2]。②神经损伤程度：患者入院时，使用美国卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）进行评估[6]，其包括意识水平、凝视、视野、面瘫、上下肢运动、肢体共济运动、感觉、语言、构音障碍、忽视共11个项目，总分为各项相加，分数越高神经损伤程度越重，轻度损伤≤4分，中度损伤为5～15分，重度损伤≥16分。
1.3.2 血清生化指标的检测：采集所有入组对象第二天晨起空腹静脉血10 ml，以3 000 r/min离心10 min（离心半径14 cm），置于-80℃冷藏器中备用。严格按照检测试剂盒操作说明，使用双抗体酶联免疫吸附法检测血清中Beclin-1，3-MST和TSP-1的水平。
1.3.3 随访：记录ACI患者自入院起二个月内预后情况，出院患者以电话或门诊复查的方式进行随访，随访过程中无失访，按生存结局分为存活组（113例）、死亡组（37例）。
1.4 统计学分析 数据分析使用SPSS version 23.0进行。计量资料符合正态分布使用均数±标准差（±s）表示，组间差异使用独立样本t检验分析或多因素方差分析；
计数资料使用n（%）表示，组间差异使用χ2检验分析。使用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）计算Beclin-1，3-MST和TSP-1对患者死亡的预测效能。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 研究组与对照组血清Beclin-1，3-MST和TSP-1表达水平的比较 研究组患者血清Beclin-1（2.13±0.57 ng/ml），TSP-1（171.45±31.66 ng/ml）水平明显高于对照组（0.88±0.29ng/ml，86.29±20.52 ng/ml），而3-MST（3.05±0.51ng/ml）水平明显低于对照组（5.11±0.79ng/ml），差异具有统计学意义（t=20.234, 23.767, 25.061,均P＜0.001）。
2.2 不同梗死面积ACI患者血清Beclin-1，3-MST和TSP-1表达水平的比较 见表1。血清Beclin-1和TSP-1表达水平，大面积组高于中面积组（t=6.984,3.723）和小面积组（t=16.139, 17.403），中面积组高于小面积组（t=6.477, 14.175），差异具有统计学意义（均P＜0.001）；
血清3-MST表达水平，大面积组低于中、小面积组（t=18.970, 22.795），中面积组低于小面积组（t=4.530），差异具有统计学意义（均P＜0.001）。
表1 不同梗死面积ACI患者血清Beclin-1，3-MST和TSP-1表达水平比较（±s, ng/ml）
表1 不同梗死面积ACI患者血清Beclin-1，3-MST和TSP-1表达水平比较（±s, ng/ml）
项目 小面积组（n=71）中面积组（n=42）大面积组（n=37） F值 P值Beclin-1 1.59±0.33 2.15±0.59 3.14±0.67 112.922<0.001 3-MST 4.67±0.97 3.84±0.89 0.96±0.26 248.483<0.001 TSP-1 122.17±25.79 201.49±33.19 231.91±39.43 171.981<0.001
2.3 不同神经损害程度ACI患者血清Beclin-1，3-MST和TSP-1表达水平比较 见表2。血清Beclin-1，TSP-1表达水平，重度损伤组高于中度损伤组（t=8.974, 6.180）和轻度损伤组（t=22.348,21.626），中度损伤组高于轻度损伤组（t=8.447,14.079），差异具有统计学意义（均P＜0.001）；
血清3-MST表达水平，重度损伤组低于中度损伤组（t=22.198）和轻度损伤组（t=32.780），中度损伤组低于轻度损伤组（t=6.856），差异具有统计学意义（均P＜0.001）。
表2 不同神经损害程度ACI患者血清Beclin-1，3-MST，TSP-1表达水平的比较（±s, ng/ml）
表2 不同神经损害程度ACI患者血清Beclin-1，3-MST，TSP-1表达水平的比较（±s, ng/ml）
项目 轻度损伤组（n=75）中度损伤组（n=38）重度损伤组（n=37） F值 P值Beclin-1 1.35±0.48 2.29±0.69 3.55±0.51 202.342<0.001 3-MST 4.65±0.69 3.68±0.75 0.84±0.21 461.708<0.001 TSP-1 113.25±30.19 203.61±35.97 256.39±37.99 246.191<0.001
2.4 不同预后ACI患者血清Beclin-1，3-MST和TSP-1表达水平比较 见表3及图1。血清Beclin-1，TSP-1表达水平，死亡组（3.15±0.78 ng/ml，277.49±39.55ng/ml）高于存活组（1.79±0.68ng/ml，136.73±30.78ng/ml），血清3-MST表达水平，死亡组低于存活组（2.27±0.75ng/ml vs 3.31±0.91ng/ml），差异具有统计学意义（t=10.176, 22.433, 6.284，均P＜0.001）。
图1 Beclin-1，3-MST，TSP-1预测ACI患者死亡的ROC曲线
表3 Beclin-1，3-MST，TSP-1对ACI患者死亡的预测效能
2.5 Beclin-1，3-MST和 TSP-1对 ACI患者死亡的预测效能 Beclin-1，3-MST和TSP-1预测ACI患者死亡的AUC分别为0.802，0.649，0.885，三者联合诊断的AUC为0.925，高于Beclin-1（z=4.397，P＜0.001），3-MST（z=4.793，P＜0.001）、TSP-1（z=4.552，P＜0.001）任一单项指标。
急性脑梗死（ACI）发病机制较为复杂，脑部血液的供应动脉出现粥样硬化和血栓形成，进而造成管腔狭窄、闭塞，继而引发区域性脑组织出现缺血，是其发生的主要过程。脑部局灶性血供减少，会损伤周围神经元细胞、神经胶质细胞等，造成神经功能损害，诱发感觉及运动异常，甚至意识障碍，进而危及患者生命[1-4]。对于ACI患者来说，时间就是生命，早诊早治仍是临床工作重点，但现阶段尚缺乏敏感预测指标，仍需进一步探索。Beclin-1，3-MST和TSP-1是近年来新发现的与神经损伤修复、血管重建等关系密切的生物学指标，三者与ACI的进展可能密切相关。
自噬相关蛋白Beclin-1属于机体酵母Apg6/Vps30基因同源物，存在于多数哺乳动物体内，当体内出现氧化应激、神经毒性反应时，其激活机体自噬反应，且与死亡相关蛋白结合，进而诱导细胞凋亡。细胞自噬参与细胞生长及分化的各个阶段，在神经损伤及保护、抗衰老等方面发挥不同作用[2]。有研究[7]发现Beclin-1是自噬启动的象征，在脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带灰质中表达显著升高，预示其在脑损伤中激活过度自噬。还有研究[8]显示ACI患者脑梗死面积越大、神经损伤越严重，血清Beclin-1表达水平越高，且死亡患者血清表达水平高于存活患者，但Beclin-1与ACI具体量化关系并未分析。本研究结果显示ACI患者血清Beclin-1表达水平升高，且随着患者的病情加剧不断升高，提示其可能参与了ACI的发生、进展。脑组织缺血损伤后，机体主要通过抑制自噬而保护神经，而Beclin-1在自噬激活过程中发挥重要作用，其主要通过与PI3K和Atg14结合持续趋化自噬相关蛋白介导自噬激活，进而引起神经细胞自噬损伤[9-10]。本研究也发现死亡患者血清Beclin-1明显高于存活组，且Beclin-1对患者死亡具有较高的预测价值，提示其与患者预后关系密切，可作为评估患者预后的可靠指标。
疏基丙酮酸硫基转移酶（3-MST）是神经系统生成的脑保护因子硫化氢（H2S）关键酶之一，主要表达于中枢神经系统内[3]。ACI患者脑组织缺血低氧可触发一系列炎症级联反应及氧化应激损伤，其导致3-MST活性下降、3-MST/ H2S通路受阻，引起3-MST及H2S水平降低[11]。有文献报道[11-12]ACI患者血清3-MST明显降低，且随着患者脑梗死面积加大、神经损伤加重，其水平愈发降低，但并未报道与患者预后的关系。本研究结果显示ACI患者血清3-MST表达水平降低，随着患者的病情加剧不断降低，且死亡患者较存活患者下降更为明显，提示其不仅参与了ACI的发生、发展，而且还与患者预后密切相关。笔者推测ACI患者血清3-MST水平降低可能是ACI患者脑组织缺血缺氧触发一系列氧化应激损伤级联反应，进而产生过氧化氢等多种氧化剂，通过降低3-MST活性、阻断3-MST/ H2S通路等，抑制3-MST的生成。
凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）属于TSPs家族成员之一，其可与细胞膜上多种配体特异性结合进而影响细胞黏附、增殖、血管新生、血液凝固等不同作用[13]。有研究[14]显示TSP-1属于血管生成抑制剂，可阻断血管生成素的细胞内皮迁移、生长及微血管生长作用。还有研究[15]显示，动脉粥样硬化中血栓斑块内TSP-1含量明显升高，其可能发挥血小板黏附而促进血栓形成。TSP-1促进血栓形成的机制可能有两方面，其一是TSP-1可与纤维蛋白原和血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa结合进而介导血小板聚集形成血栓[16-17]；
再者TSP-1可与血小板膜糖蛋白Ib结合介导血小板趋化黏附聚集[18-19]。在本研究中，ACI患者血清TSP-1明显升高，且随着患者病情的加重逐渐加剧，提示TSP-1促血栓形成作用在疾病进展方面发挥重要作用。此外，死亡ACI患者血清TSP-1水平明显高于存活患者，提示TSP-1促血栓形成作用加速患者病情进展，进而引起患者不良预后。具体原因可能在于TSP-1通过抑制微血管生成、促进血小板聚集黏附，进而加速血栓形成导致患者病情加重及预后不良。
此外，本研究预测效能分析显示Beclin-1，3-MST和TSP-1对ACI患者死亡均具有较高的预测价值，更进一步证实三者与ACI发生、发展密切相关。同时，三者联合诊断的AUC高于任一单项指标，三者联合检测有利于患者病情及预后的早期评估，提高整体诊疗的有效性，可指导临床采取有效干预措施延缓疾病进展、改善患者预后。
综上所述，ACI患者血清中Beclin-1，TSP-1表达水平显著升高，3-MST表达水平明显降低，三者与患者脑梗死面积及神经损伤程度密切相关，且三者对患者预后均有较高的预测价值，且三者联合检测有助于患者病情及预后的早期评估。然而，本研究亦有单中心研究、样本量相对不足之缺点，未来应基于大样本量进行多中心研究以证实三者之效能。
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