韩冰，商静敏，申永静，李贤伟，赵丽静
(邯郸市妇幼保健院 小儿呼吸科，河北 邯郸 056001)
毛细支气管炎是婴幼儿最常见的急性下呼吸道感染，其临床表现从有轻度下呼吸道症状到下呼吸道阻塞引起的严重呼吸窘迫等[1- 3]。抗菌肽是一种阳离子肽，构成先天免疫系统的基本元素，其在呼吸道中的作用尤为重要。其中人类β- 防御素(hBDs)和人组织蛋白酶抑制素抗菌肽18(human cathelicidin anti- microbial peptide 18，hCAP- 18)是呼吸道先天性和适应性免疫反应的关键因素。hCAP- 18可被切割成唯一有生物活性的N端含有双亮氨酸的37个氨基酸残基的小分子肽(37 amino acid residues with dileucine at the N- terminus，LL- 37)[4]，近期的研究[4- 6]支持了其在新的抗病毒策略中的治疗潜力。此外有实验室研究表明，维生素D在感染时可上调抗菌肽LL- 37的表达，通过调节细胞因子的产生抑制炎症，进而减轻病毒性下呼吸道感染的严重程度[7]。然而目前尚缺乏相关研究，本研究旨在分析LL- 37及hBD2的黏膜生成与毛细支气管炎患儿血清维生素D水平、急性期病情严重程度及反复喘息之间的关系。
1.1 研究对象
本研究为前瞻性队列研究，于2017年2月至2020年4月在我院小儿呼吸科进行。研究方案在启动前获得了医院伦理委员会的批准，所有参与本研究儿童的父母均知情同意。共纳入101例毛细支气管炎患儿，男55例(占54.46%)，年龄0.8～15.9岁。纳入标准：(1) 年龄≤16岁；
(2) 首次因患毛细支气管炎住院治疗；
(3) 毛细支气管炎被定义为以咳嗽、呼吸急促和胸部收缩为特征的第一次喘息发作，经体格检查及胸部X线检查符合《诸福棠实用儿科学(第七版)》[8]中毛细支气管炎的诊断标准。排除标准：(1) 母亲妊娠期短于34周的早产儿，有既往喘息史、慢性肺病、先天性心脏病、神经发育障碍、免疫缺陷和免疫抑制、过敏性鼻炎、支气管内存在异物、寄生虫感染；
(2) 预防性使用帕利珠单抗；
(3) 合并严重肝、肾器官功能障碍。
1.2 基线数据和样本采集
收集患儿的年龄、性别、体重、身高、体温、脉搏、既往呼吸道感染史、症状、病毒学检测结果、抗生素使用史、住院治疗时间，以及实验室检查结果[白细胞计数(WBC)、糖化血红蛋白(HbA1c)水平、中性粒细胞计数(NEUT)、单核细胞计数(MONO)、淋巴细胞计数(LY)、血小板计数(PLT)、降钙素原(PCT)水平]。在初次接触、未进行医疗干预之前，所有患儿完成抽血和鼻咽拭子检查。血液样本均在采血后1 h内3 000 r·min-1离心10 min。鼻分泌物采用真空辅助吸引法收集，无化学刺激，避免异物进入鼻液。轻柔地操作鼻道内装有窄橡胶头的真空装置，轻度刺激鼻腔分泌物，标本采集后立即用抑肽酶(0.6 TIU·ml-1)处理，以阻止蛋白水解酶的作用。样本均于-20 ℃下冷冻保存，待进一步分析。
1.3 样本检测
使用Abbott ARCHITECT化学发光微粒免疫分析法测定25- 羟维生素D[25(OH)D]水平。另外采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国Phoenix Pharmaceutical公司)定量检测hBD2及LL- 37水平。所有ELISA检测包括用于构建分析物水平评估标准曲线的内标准品检测都重复进行。
1.4 急性期疾病严重程度
患儿临床病情的严重程度在每个住院日使用改良Wang氏毛细支气管炎严重程度评分(简称改良Wang评分，该评分用血氧饱和度替换患者的一般状况；
0～4.9分为轻度，5～8.9分为中度，9～12分为重度)及住院治疗时间[9]进行判定。
1.5 随访评估
患儿出院后，每6个月进行1次门诊或电话随访，记录患儿喘息发生情况，至随访截止时喘息发作≥3次的患儿纳入反复喘息组，<3次者纳入非反复喘息组(2次发作时间间隔≥1周)，随访期限为2年。
1.6 统计学处理
2.1 鼻分泌物抗菌肽水平与患儿临床病理特征的相关性
患儿鼻分泌物LL- 37和hBD2水平分别为17.63(11.67，33.30)ng·mg-1和93.39(75.92，107.29)ng·mg-1。根据鼻分泌物LL- 37水平17.63 ng·mg-1和hBD2水平93.39 ng·mg-1的中位值，将患儿分别纳入低水平组和高水平组。经分析，LL- 37低水平组患儿脉搏>100 次·min-1及呼吸道合胞病毒(RSV)感染例数显著高于高水平组患儿(P<0.05，表1),但hBD2低水平组和高水平组患儿的临床病理特征差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 毛细支气管炎患儿鼻分泌物抗菌肽水平与临床病理特征的相关性 例
2.2 患儿鼻分泌物抗菌肽水平、血清25(OH)D水平与急性期疾病严重程度的相关性
经Spearman秩相关分析，患儿血清25(OH)D水平与住院时间(r=-0.145，P=0.148)、改良Wang评分得分(r=-0.201，P=0.052)、鼻分泌物hBD2水平(r=0.087，P=0.388)均无关，但与鼻分泌物LL- 37水平(r=0.257，P=0.009)呈正相关。鼻分泌物LL- 37水平与住院时间(r=-0.343，P<0.001)、改良Wang评分得分(r=-0.495，P<0.001)呈负相关，鼻分泌物hBDs水平与住院时间(r=-0.072，P=476)、改良Wang评分得分(r=-0.032，P=754)无相关性。进一步校正年龄、性别、临床表现等因素后，经多元线性回归分析，鼻分泌物LL- 37水平仍是改良Wang评分得分的独立影响因素(β=-0.062，95%CI为-0.090～-0.033，P<0.001)。
2.3 单因素和多因素Logistic回归分析影响毛细支气管炎患儿反复喘息的临床因素
本研究共有17例毛细支气管炎患儿在随访期间发生反复喘息。经单因素和多因素Logistic回归分析，脉搏及鼻分泌物LL- 37水平都是患儿发生反复喘息的独立影响因素(P<0.001，表2)。
表2 单因素和多因素Logistic回归分析毛细支气管炎患儿反复喘息的影响因素
2.4 鼻分泌物抗菌肽水平对毛细支气管炎患儿反复喘息的预测价值
经ROC曲线分析，鼻分泌物LL- 37和hBD2水平预测毛细支气管炎患儿反复喘息的AUC分别为0.773(95%CI为0.669～0.876)和0.555(95%CI为0.410～0.699)，见图1。
毛细支气管炎是一种自限性的急性呼吸系统疾病，但部分患儿会出现反复喘息[10- 11]。有研究证实，维生素D可以降低病毒感染的风险，它通过调节紧密连接、黏附连接及缝隙连接蛋白的产生来改善身体的物理屏障，这些蛋白可被微生物(包括病毒)感染所干扰[12- 13]。维生素D可刺激抗菌肽的产生，抗菌肽对各种微生物都有一定的生物活性。例如大多数病毒产生的双链RNA可增加1α- 羟化酶的表达，导致活性维生素D的产生和抗菌肽在人气管支气管上皮细胞中的表达增加。因此，充足的维生素D可能通过增强物理屏障和增加肺上皮抗菌肽的产生来阻止病毒的入侵，而抗菌肽LL- 37及hBDs已被证实与病毒性呼吸系统疾病相关[14]。然而在本研究中我们发现，毛细支气管炎患儿的血清25(OH)D仅与鼻分泌物LL- 37水平有相关性，而与hBDs无相关性，此外急性毛细支气管炎患儿鼻腔分泌物中抗菌肽LL- 37水平与住院时间、RSV感染以及Wang评分得分呈显著负相关。说明抗菌肽LL- 37可能参与了急性毛细支气管炎的病情进展。
LL- 37是最具抗病毒活性的抗菌肽，该肽主要存在于中性粒细胞特异性颗粒中，但也可由其他类型的细胞(包括上皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)产生和分泌。LL- 37可直接作用于一系列呼吸道病原体，包括流感病毒、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌和RSV[15- 16]。在本研究中，感染RSV的患儿鼻分泌物LL- 37水平更低。LL- 37在多种疾病(如克罗恩病、溃疡性结肠炎、尿路感染、银屑病等感染性疾病，卵巢癌、肺癌等癌症，心血管疾病等[17])中均发挥重要作用。王璐等[18]指出，哮喘患儿血清LL- 37水平显著升高，提示其参与支气管哮喘的发生。此外，LL- 37可通过破坏RSV包膜的完整性并阻止细胞结合来抑制RSV复制，进而发挥抗病毒活性[19]。本研究中毛细支气管炎患儿鼻分泌物LL- 37水平与急性期疾病严重程度呈负相关，而且调整多种客观的混杂因素后亦是如此。经分析，鼻分泌物LL- 37水平还对患儿反复喘息的发生有良好的预测效能，这与Papadaki等[9]的研究结论相符。此外鼻腔分泌物似乎比血清更能反映肺部状态，因此我们的研究结果可能具有潜在的重要意义。
本研究首次将低水平鼻分泌物抗菌肽与毛细支气管炎严重程度及RSV感染联系起来，然而尚不清楚LL- 37水平与疾病严重程度之间的因果关系，因此在将来需要进一步研究LL- 37作为需要重症监护的毛细支气管炎患儿潜在治疗靶点的可靠性。
综上，本研究发现，较低的鼻分泌物LL- 37水平与毛细支气管炎急性期疾病严重程度(较高的Wang氏评分得分和较长的住院时间)及慢性发病率(反复喘息)显著相关，提示检测鼻分泌物LL- 37水平可以预测儿童急性毛细支气管炎的疾病进展。我们的观察结果将有助于进一步研究抗菌肽在毛细支气管炎及其远期后遗症的病理生理学中的作用。尽管毛细支气管炎的病理学机制很复杂，但维生素D和抗菌肽之间的关联为治疗提供了一个潜在的方向，抗菌肽LL- 37有可能是一个有吸引力的治疗靶标，为预防和治疗毛细支气管炎及其慢性疾病提供新途径。
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