栗向军，张鹏远
（1.郑州颐和医院神经外科，河南 郑州 450000；
2.郑州大学第二附属医院神经外科，河南 郑州 450000）
高血压脑出血（Hypertensive intracerebral hemorrhage，HICH）是由于长期高血压所致的脑部自发性出血[1]。多数患者发病前无明显前驱症状，起病急骤，表现为突然出现的剧烈头痛、恶心、呕吐，多伴有肢体功能障碍、感觉障碍、失语等症状，若未及时治疗，可出现颅内压增高，引起血肿侧瞳孔散大等危机患者生命的体征[2]。中国脑出血诊治指南（2019版）数据显示[3]，我国每年HICH新发人数越为17～21万人，发病30 d的病死率高达35%～52%，仅有约20%的患者治疗后6个月内能够恢复基本生活功能。因此，其治疗及预后难度是目前临床亟待解决的热点和难点。已有研究报道[4]，沉默信息调节因子1（Silent information regulator 1，SIRT1）是一种编码广泛表达的NAD依赖性蛋白质脱乙酰基酶，可通过使组蛋白去乙酰化作用调节相关基因转录，起到血管内皮保护作用。PTEN诱导激酶1（PTEN-induced kinase 1，PINK1）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可以反映线粒体的损伤[5]。Parkin蛋白广泛分布于脑内，参与细胞周期、生长代谢、免疫应答和胞内信号转导的调节[6]。本研究旨在探讨外周血中SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达水平对HICH患者术后不良预后的预测价值，以期为临床诊断和预后评估预后提供更多循证数据支持。
1.1 一般资料 回顾性分析2018年6月至2021年6月在本院诊治的102例HICH患者，根据术后格拉斯哥昏迷评分（GCS）情况分为预后良好（GOS≥7分）组（n=73）和不良（GOS＜7）组（n=29）。纳入标准：符合《高血压性脑出血中国多学科诊治指南》[7]中相关的诊断标准；
经影像学诊断为脑出血；
存在高血压史；
临床资料完整；
通过医院伦理委员会批准。排除标准：非高血压引起的脑出血者；
存在严重心、肝、肾疾病者；
合并自身免疫性疾病者。预后良好组与不良组在性别、年龄、出血部位等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。
表1 两组患者的一般资料比较[n，±s]
组别n 年龄（岁）性别（n）男女皮质出血部位（n）内囊基底节 丘脑 小脑良好组不良组t/χ2 P 73 29 60.83±7.42 61.71±6.18 0.565 0.659 51 16 1.987 0.159 22 13 13 8 39 12 1.602 0.659 14 6 7 3
1.2 方法
1.2.1 外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达检测主要仪器与试剂：台式高速冷冻离心机（美国thermo公司），Hanks液（Solar bio公司），淋巴细胞分层液（Solar bio公司），BCA蛋白定量试剂盒（江苏凯基生物），5X蛋白上样缓冲液（上海生工），PVDF膜（深圳市凯宏膜），SIRT1、PINK1、Parkin单克隆抗体（武汉ABclonal公司）。
方法：取静脉血2 mL解冻，加入同体积Hanks液混匀，缓慢加入装有同体积淋巴细胞分层液的试管中，离心沉淀（1 500 r/min，20 min），保留中间云雾层细胞液，继续加入5倍体积的Hanks液，同样转速离心5 min，保留分离后的PBMC；
取40μL的PBMC稀释液，加入350μL细胞裂解液，严格按照蛋白裂解步骤提取总蛋白，BCA蛋白定量，Western blot蛋白印迹法检测PBMC中SIRT1、PINK1、Parkin蛋白的表达水平，依次SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜至PVDF膜、室温密封2 h，洗膜并加一抗4℃孵育过夜，洗膜加二抗室温孵育2 h。再用ECL化学发光显示，收集影像，通过Image J凝胶成像分析系统对比条带强弱，选用β-actin作为内参，分析蛋白相对表达量。
1.2.2 观察指标 根据本研究目的，自行设计调查表，通过电子病例系统收集所有纳入对象的性别、年龄、出血部位、出血量、主演时间、术后2 h格拉斯哥昏迷评分（Glasgow coma scale，GCS）等一般资料，资料收集工作由医院专职人员完成。
GCS的总分为15分，一般来说，12～15分为轻型昏迷；
7～12分为中度昏迷；
而7分以下为重度昏迷（预后不良）[8]。分析外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达与GCS评分的相关性及对患者预后的预测价值。
1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料（±s）两组间差异采用独立t检验分析；
计数资料（n，%）组间差异采用χ2检验；
采用Pearson相关性分析外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达与GCS评分的相关性，采用受试者 工 作 特 征 （Receiver operating characteristic，ROC）曲线评价外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达对HICH患者术后预后的预测价值，P＜0.05提示有统计学意义。
2.1 两组患者手术相关指标比较 两组患者的住院时间差异比较无统计学意义（P＞0.05），不良组出血量高于良好组、术后GCS评分低于良好组（P＜0.05）。见表2。
表2 两组患者手术相关指标比较（±s）
表2 两组患者手术相关指标比较（±s）
组别 n良好组不良组73 29 t P出血量（mL）术后G C S评（分）46.94±4.56 58.22±3.29 12.112＜0.001 10.16±2.47 5.28±1.35 10.041＜0.001住院时间（d）7.21±1.22 7.65±2.34 1.242 0.217
2.2 两组患者的外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达水平 不良组患者外周血PINK1水平明显高于良好组，SIRT1、Parkin水平明显低于良好组，组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表3。
图1 两组患者的外周血SIRT1、Pink1、Parkin蛋白表达条带图
表3 两组患者的外周血SIRT1、Pink1、Parkin蛋白表达水平（±s）
表3 两组患者的外周血SIRT1、Pink1、Parkin蛋白表达水平（±s）
组别 n良好组不良组73 29 t P SI R T1 P I N K1 0.48±0.07 0.27±0.08 13.117＜0.001 0.52±0.01 0.74±0.02 20.303＜0.001 P a r k in 0.89±0.02 0.51±0.03 14.498＜0.001
2.3 外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达与GCS评分的相关性 以术后GCS评分作为自变量，外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达作为因变量，术后GCS评分与外周血PINK1蛋白表达呈负相关（r=-0.683，P＜0.001），与SIRT1、Parkin蛋白表达呈正相关（r=0.753、0.819，P＜0.001）。
2.4 外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达水平对不良预后的预测价值 以外周血SIRT1、PINK1、Parkin单独检测和联合检测作为检验变量，是否发生不良预后作为状态变量进行ROC曲线分析，曲线下面积AUC分别为0.757、0.769、0.767、0.856(P＜0.05)。见图2、表4。
图2 外 周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达水平对不良预后的预测价值
表4 外 周 血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达水平对不良预后的预测价值
HICH是由于长期高血压导致脑内小动脉管壁发生变性、缺血、坏死、微小动脉瘤形成等病理改变，当血压骤然升高时，导致小动脉血管发生破裂出血；
该病按出血部位分为基底节区出血、丘脑出血、脑叶出血、小脑出血和脑室出血[9]。HICH的治疗包括内科治疗和外科治疗，治疗原则以控制出血、降低颅内压和防治并发症的发生为主[10]。手术治疗可有效清除血块、降低颅内压和减少血肿对周围脑组织的损伤，最大程度降低致残率[11]。既往研究报道，HICH手术的预后与出血部位、出血量的情况密切相关[12]，本次研究结果发现，预后不良组与良好组的出血量有统计学差异，出血部位无统计学差异，与上述结论存在部分差异，分析原因可能是本次研究样本数量较少，且为回顾性研究，可能存在部分个体差异。但同样可提示对于出血量较高的患者，临床需重点关注，实时检测其生命体征，预防不良预后发生。
目前HICH术后发生不良预后的发病原因尚无统一的明确标准，相关研究报道[13]，继发性脑损伤是影响HICH预后的关键，而神经炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等是继发脑损伤的重要因素。中国脑出血诊治指南报道[3]，GCS评分能够作为评估脑出血患者的预后指标，本此研究结果显示，预后不良组的GCS评分明显低于良好组，且低于预后不良的临界值，进一步证实了GCS评分可作为预后不良的判定指标。已有研究报道[14]，SIRT1是存在于多种生物中的高度保守基因，在多种疾病中参与氧化应激反应的调控，能够促进血管内皮细胞NO合酶的活性，改善内皮功能。PINK1、Parkin位于同一条信号通路上，共同发挥线粒体自噬作用。相关研究报道[15-16]，健康状态下，细胞PINK1表达较低，因为线粒体内膜上的蛋白酶对其有降解作用；
Parkin蛋白具有良好的调节和控制作用，可维持多巴胺能神经元的正常功能，防止脑组织进一步损伤。本次研究结果发现，不良组患者外周血PINK1水平明显高于良好组，SIRT1、Parkin水平明显低于良好组，进一步验证了上述结论，分析其原因可能是，SIRT1能够使p53去乙酰化，阻断其诱导的细胞凋亡，起到神经保护作用[17]；
而PINK1异常增加导致线粒体自噬障碍，进而导致Parkin缺陷，因此预后不良患者外周血PINK1水平较高、，SIRT1、Parkin水 平 较 低。
提 示SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达可作为预测HICH术后不良预后的指标。
国外研究报道[18-19]，SIRT1、PINK1、Parkin作为氧化应激的重要调控因子，与多种疾病的严重程度、病情发展以及预后恢复效果密切相关。本次研究结果发现，术后GCS评分与外周血PINK1蛋白表达呈负相关 （r=-0.683，P＜0.001），与SIRT1、Parkin蛋 白 表 达 呈 正 相 关 （r=0.753、0.819，P＜0.001），进一步验证了上述结论，说明随着脑血管损伤病情加重，外周血PINK1表达异常减少、SIRT1、Parkin表达异常增多，分析其原因可能是，GCS评分与患者的意识状态、语言反应和肢体运动三个方面有关，若分数越低，意识障碍越严重，表明脑损伤程度越严重，则外周血PINK1表达减少、SIRT1、Parkin表达增多。提示SIRT1、PINK1、Parkin可作为预测预后不良的指标。本次研究中，进一步以外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达单独检测和联合检测作为检验变量，是否发生不良预后作为状态变量进行ROC曲线分析，曲线下面积AUC分别为0.757、0.769、0.767、0.856，进一步证实外周血SIRT1、PINK1、Parkin蛋白表达可作为高血压出血患者术后不良预后的独立预测因子，其中联合检测的预测价值高于单独检测，提示临床可根据患者实际病情结合三项蛋白表达情况预防不良预后，防止病情复发或进一步恶化。
综上所述，HICH患者术后外周血SIRT1、PINK1、Parkin表达对不良预后有较好的预测价值，SIRT1和Parkin蛋白表达越低、PINK1表达越高，GCS评分越低，预后不良发生率越高。但本研究仍有一定的局限性，一是样本量相对较小，二是检测指标均为血清样本指标，因此在统计分析上可能会有偏差。需要进一步采用对应的基因治疗前瞻性研究进行深入探索，以期为防治HICH的术后不良预后提供更加全面的循证支持。
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