陈秋燕，王瑞芳，王 园，安晓萍，杨艳平，宋 敏，齐景伟
(内蒙古农业大学动物科学学院；
内蒙古自治区草食家畜饲料工程技术研究中心2,呼和浩特 010018)
小麦是我国重要的粮食作物之一，麦麸是小麦加工的副产物，资源十分丰富。研究发现麦麸富含丰富的多糖、矿物质、膳食纤维、酚类物质和维生素等营养成分[1，2]。多糖是麦麸中最典型的功能性物质。麦麸多糖主要由非淀粉多糖组成，其含量高达46%左右，是小麦细胞壁的主要成分。研究发现，麦麸多糖具有抗氧化、降低胆固醇、提高机体免疫力、抗癌、降血脂、降血压等多种功效[3-7]，而我国目前大部分麸皮仅被用于传统酿酒、饲料等领域，仍缺乏对小麦麸皮资源的深度开发利用，对其功能性食品的开发仍处于较低水平，因此，如何更高效地利用麦麸资源，对提高其附加值具有重要的意义。对于麦麸中活性多糖的提取目前常采用热水浸提法、超声波辅助提取法和酶解法等[8-10]。近年来的研究发现，通过益生菌发酵麦麸可提高其多糖、酚酸和糖醛酸等生物活性物质的含量[11]，发酵可以使微生物产酶过程与酶作用过程合二为一，是一种控制营养物质释放的可行方法，比物理或者化学法具有高特异性、高效率、副作用少等特点，因此，已得到广泛应用[12-14]。
利用体外实验(包括细胞、生化、微生物等)评价天然产物的抗氧化活性，虽具有高效、快速的优点，但其结果难与人体实验结果相比[15]。利用小鼠等哺乳动物模型研究天然物质的抗氧化活性已较为普遍，但这一方法存在成本高、周期长、操作复杂等问题，不便于进行在体内的功能研究。斑马鱼(Daniorerio)是国际认可的新型模式生物，具有体积小、繁殖周期短、产卵量大、胚胎透明、生理结构和功能与哺乳动物高度相似等特点，已被美国国家卫生研究所列为继人类和小鼠后的第三大模式生物。另外，利用斑马鱼模型开展相关研究具有材料易获得、易操作、周期短、高效、费用低等优势，且具有对哺乳类动物实验预测性强、可比度高等优点，因此，可以有效弥补体外实验和哺乳动物实验之间的巨大生物学断层，已被广泛用于天然产物生物活性评价[16,17]，特别是其体内抗氧化活性的评价[18,19]。
利用枯草芽孢杆菌与酿酒酵母发酵麦麸后其粗多糖具有较强的自由基清除能力[20]；
发酵麦麸阿魏酰低聚糖可通过提高大鼠血浆和组织中抗氧酶活性降低 DNA氧化应激代谢产物8-OHdG的含量，从而有效缓解由敌草快诱导产生的氧化应激[21]；
证明了发酵麦麸多糖在体外及体内鼠模型中均具有较强的抗氧化活性。然而，关于未发酵麦麸多糖与发酵麦麸多糖抗氧化活性的对比研究鲜有报道。因此，本研究拟以分离纯化后的未发酵与发酵麦麸多糖作为原料，以斑马鱼作为实验动物，对比研究发酵对 麦麸多糖抗氧化活性的影响，研究结果将为麦麸资源的深度开发利用和抗氧化剂的开发提供参考。
1.1 材料与试剂
麦麸：市售；
斑马鱼成鱼来源国家斑马鱼资源中心(中国，武汉)；
2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCF-DA)、1,3-双(二苯膦)丙烷(DPPP)、吖啶橙(AO)、二甲基亚砜(DMSO)、间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)，其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅，LRH-250F生化培养箱，IX51奥林巴斯倒置显微镜，微孔板分光光度计，倒置荧光显微镜TS2R。
1.3 实验方法
1.3.1 麦麸多糖的制备
麦麸的发酵参照史俊祥[20]的方法，以B.subtilis(CGMCC 1.892)和S.cerevisiae(CGMCC 2.119)为菌种，含量为1×108CFU/mL，接种比例为3.3∶6.7，将菌种按照体积分数10.4% 接种量与麦麸混合，料水比为1∶1.16，于36 ℃条件下发酵47 h得到发酵麦麸；
将同样的菌比、接种量、料水比添加到麦麸中得到未发酵麦麸。将未发酵与发酵后的麦麸湿样分别置于45 ℃烘箱中烘干48 h，粉碎过筛，准确称取未发酵与发酵麦麸粉各100 g置于1 000 mL蒸馏水中，80 ℃热水浸提30 min，3 500 r/min离心15 min，取上清液进行浓缩，采用sevage法对浓缩液进行去蛋白，用80%乙醇进行沉淀，4 ℃条件下沉淀12 h，离心，取沉淀进行减压浓缩，再进行冷冻干燥获得未发酵与发酵麦麸粗多糖。进一步利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱对麦麸粗多糖进行分离纯化，以蒸馏水为洗脱剂，流速为0.5 mL/min进行洗脱，收集组分旋转蒸发，冷冻干燥，最终获得未发酵麦麸多糖(WBP)与发酵麦麸多糖(FWBP)。
1.3.2 斑马鱼的饲养及胚胎收集
野生型斑马鱼亲鱼购于国家斑马鱼资源中心，饲养于内蒙古农业大学动物科学学院，在(28.5±1)℃、14/10 h光/暗周期条件下饲养，每日交替饲喂人工配合饲料和初孵丰年虫4次，饲喂1 h后清除残饵和粪便，每天换水1/3，养殖期间持续充氧，定期监测水质参数。
胚胎收集方法：实验前一天晚上按照雌∶雄为1∶2的比例挑选健康斑马鱼亲鱼15尾置于孵化箱中，并用隔板将雌、雄鱼分开，保持鱼房黑暗环境，于第2天早上将隔板移除，利用自然光照刺激亲鱼产卵，30 min后将胚胎收集于培养皿中，用胚胎培养液清洗数次，放置于干净的烧杯中培养备用。
1.3.3 WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎发育的影响
在体视显微镜下挑选受精后7～9 hpf且发育正常的斑马鱼胚胎放置于含有2 mL不同质量浓度(0、25、50、100、200、300 μg/mL)WBP和FWBP培养液的24孔板中，每个质量浓度设置4重复(孔)，每个重复10枚胚胎。将24孔板放在控温水浴锅(28.5 ℃)中孵化，每隔12 h更换1次培养液，受精后24、48、72、96 h分别在体视显微镜下观察胚胎发育状况，统计胚胎死亡率，在96 hpf统计胚胎孵化率。从48 hpf开始在显微镜下记录仔鱼心率，并采集其侧面照测量不同处理组初孵仔鱼体长、计算卵黄囊体积。每个重复组随机挑选4尾仔鱼，计数其在60 s内的心跳次数。体长为从仔鱼吻短到尾柄基部的距离，卵黄囊体积大小计算依据公式：
V=a×b2/6
式中：a和b分别为卵黄囊主轴和副轴的长度。
胚胎死亡率为96 h内死亡胚胎总数占放入胚胎总数的百分比；
96 hpf胚胎的孵化率为该时间点孵化出膜仔鱼数占总胚胎数的百分比。
1.3.4 WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎抗氧化能力的影响
1.3.4.1 WBP和FWBP对斑马鱼胚胎ROS产生率、细胞死亡率和脂质过氧化率的影响
根据WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎发育影响的结果，选择50、100、200 μg/mL的WBP和FWBP进行该实验。挑选7～9 hpf的胚胎转移至含有2 mL不同质量浓度(0、50、100、200 μg/mL)WBP和FWBP胚胎培养液的24孔板中，每个质量浓度4个重复，每个重复10枚胚胎，置于28.5 ℃控温水族缸中继续孵育，在胚胎发育至24 hpf更换为正常胚胎培养液。待胚胎发育至72 hpf时从每个重复组中随机挑选5尾仔鱼进行荧光染色，其中ROS产生率、细胞死亡率和脂质过氧化率分别使用DCF-DA(20 μg/mL)、吖啶橙(7 μg/mL)和DPPP(25 μg/mL)染色。将斑马鱼仔鱼分别避光染色处理1 h、30 min、1 h后，用正常胚胎培养液清洗数次，用MS-222麻醉，置于荧光显微镜下捕获荧光照片，利用image J软件测量其荧光强度，以对照组为标准计算各处理组的相对荧光强度[22]。ROS相对产生量/细胞相对死亡率/脂质过氧化率=处理组荧光强度/对照组荧光强度×100%。
1.3.4.2 麦麸多糖对斑马鱼胚胎抗氧化酶活性的影响
挑选7～9 hpf的胚胎转移至含有2 mL不同质量浓度(0、50、100、200 μg/mL)WBP和FWBP胚胎培养液的24孔板中，每个质量浓度7个重复，每个重复40枚胚胎，置于(28.5±1)℃的水族缸中继续孵育，在胚胎发育至24 hpf时取样，用胚胎培养液清洗胚胎，置于2 mL离心管中，加入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)制成10%组织匀浆液，4 ℃，3 500 r/min离心，取上清液用于抗氧化相关指标测定。CAT、SOD、GSH-PX活性和MDA含量测试盒均为南京建成生物工程研究所产品，所有操作均严格按说明书进行。
1.4 数据分析
实验所有数据均采用“平均值±标准差”来表示，利用SAS 9.2统计软件中的ANOVA模型进行单因素方差分析，用Duncan’s检验进行多重比较，所有实验至少重复3次，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2.1 WBP和FWBP的毒性评价
2.1.1 WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎死亡率的影响
由图1可知，当WBP和FWBP暴露96 hpf，WBP和FWBP质量浓度达到或高于50 μg/mL时，斑马鱼胚胎死亡率随暴露质量浓度的升高逐渐增加，表明WBP和FWBP对斑马鱼胚胎的毒性具有明显的质量浓度依赖性，且WBP组斑马鱼胚胎死亡率显著高于FWBP组(P<0.05)。在质量浓度为200 μg/mL时WBP组胚胎死亡率接近30%，而FWBP组胚胎死亡率低于20%，当质量浓度达到300 μg/mL时，2组斑马鱼胚胎死亡率均超过50%。
注：不同小写字母表示不同质量浓度WBP与对照组之间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示不同质量浓度FWBP与对照组之间差异显著(P<0.05)，含有相同标签表示差异不显著(P>0.05)，*表示WBP与FWBP差异显著(P<0.05)，下同。
2.1.2 WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎孵化率的影响
由图2可知，与对照组相比，25～100 μg/mL的WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎孵化率无显著影响，而当WBP和FWBP质量浓度达到及高于200 μg/mL时显著降低斑马鱼胚胎的孵化率，且WBP组孵化率显著低于FWBP组(P<0.05)。
图2 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎孵化率的影响
2.1.3 WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎心率的影响
由图3可知，与对照组相比，实验质量浓度范围的FWBP和25～200 μg/mL WBP暴露对斑马鱼胚胎心率无显著影响。而与对照组跟100 μg/mL WBP相比，当WBP暴露质量浓度达到300 μg/mL时可引起斑马鱼心率显著降低(P<0.05)。
图3 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎心率的影响
2.1.4 WBP和FWBP暴露对斑马鱼初孵仔鱼体长和卵黄囊体积的影响
由图4可知，与对照组相比，当WBP和FWBP质量浓度达到300 μg/mL时，斑马鱼初孵仔鱼的体长显著减小(P<0.05)，而50 μg/mL的FWBP组斑马鱼初孵仔鱼的体长显著增加(P<0.05)，其他质量浓度组斑马鱼初孵仔鱼体长无显著变化。
图4 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎体长的影响
由图5可知，WBP和FWBP暴露对斑马鱼卵黄囊体积无显著影响(P>0.05)。
图5 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼卵黄囊体积的影响
当WBP和FWBP暴露质量浓度达到300 μg/mL导致胚胎死亡率增加、孵化率降低、体长变短，心跳减慢，显著影响斑马鱼胚胎的发育，对斑马鱼胚胎的发育表现出明显的毒性作用，综合考虑，选择50、100、200 μg/mL的WBP和FWBP进行抗氧化能力比较研究。
2.2 WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎抗氧化能力的影响
2.1.1 WBP和FWBP暴露对斑马鱼体内ROS产生量的影响
由图6可知，与对照组相比，不同质量浓度的WBP和FWBP暴露显著降低了斑马鱼体内的ROS产生量(P<0.05)，且在质量浓度为200 μg/mL时FWBP组的ROS产生量显著低于WBP组(P<0.05)。表明WBP和FWBP暴露可减少斑马鱼ROS产生量，且FWBP的作用强于WBP。
图6 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼体内ROS产生的影响
2.1.2 WBP和FWBP暴露对斑马鱼体内脂质过氧化的影响
由图7中可知，质量浓度为50～200 μg/mL 的WBP和FWBP暴露均显著降低斑马鱼体内的脂质过氧化率(P<0.05)，且质量浓度达到200 μg/mL 时FWBP对斑马鱼的脂质过氧化率的降低作用显著强于WBP组(P<0.05)。表明WBP和FWBP均能通过抑制斑马鱼仔鱼脂质过氧化，且FWBP的作用优于WBP。
图7 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼体内脂质过氧化率的影响
2.1.3 WBP和FWBP暴露对斑马鱼体内细胞死亡的影响
由图8可知，WBP和FWBP暴露均可显著降低斑马鱼仔鱼的细胞死亡率(P<0.05)，虽然WBP和FWBP之间无显著差异(P>0.05)，但FWBP处理组斑马鱼的细胞死亡率略低于同质量浓度的WBP处理组。
图8 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼体内细胞死亡的影响
2.1.4 WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎抗氧化酶活性的影响
由图9～图11可知，与对照组相比，100、200 μg/mL的WBP和FWBP暴露显著提高了斑马鱼胚胎中总超氧化物歧化酶活性，且在200 μg/mL质量浓度下FWBP组总超氧化物歧化酶活性显著高于WBP组(P<0.05)。与对照组相比，不同质量浓度的WBP和FWBP暴露均显著提高了斑马鱼胚胎中过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性(P<0.05)，且到质量浓度达到200 μg/mL时FWBP组过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于WBP组(P<0.05)。
图9 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎总超氧化物歧化酶活性的影响
图10 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎过氧化氢酶活性的影响
图11 不同质量浓度WBP和FWBP暴露对斑马鱼胚胎谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响
3.1 WBP和FWBP安全性评价
Wang等[22]评估川芎多糖对斑马鱼胚胎发育的毒性时，发现质量浓度为300 mg/L时已经显著抑制了胚胎的生长，主要表现为其体长降低了，在质量浓度为500、800 mg/L时，斑马鱼胚胎的致死率高达100%。本研究结果表明，当WBP和FWBP质量浓度达到300 μg/mL时均会导致斑马鱼胚胎心率显著降低、死亡率提高、孵化率降低及初孵仔鱼体长降低，表明高质量浓度的WBP和FWBP对斑马鱼胚胎的发育产生一定的毒性作用。而低于300 μg/mL质量浓度的WBP和FWBP对斑马鱼胚胎发育的影响相对较小。因此，本研究后续实验中选择50、100、200 μg/mL的WBP与FWBP进行抗氧化活性评价。
3.2 WBP和FWBP的抗氧化活性评价
氧化应激是体内活性氧产生与抗氧化防御系统作用失衡引起的结果，通常与不同的病理作用有着直接的相关性[24]。活性氧(ROS)是包括超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢等的化学活性分子，是自然形成的代谢副产物。ROS诱导的氧化应激会损害生物分子功能，从而导致细胞死亡和组织损伤[25]。人体抗氧化系统可分为酶类抗氧化系统和非酶类抗氧化系统，酶类抗氧化系统主要由SOD、CAT、GSH-Px等体内自身的抗氧化酶系组成，其作为体内抗氧化的第一道防线够阻断自由基链式反应，从而减少自由基的生成[26]。
本实验利用斑马鱼胚胎对比研究了WBP和FWBP的抗氧化活性，结果显示，不同质量浓度的WBP和FWBP均显著降低了斑马鱼体内ROS的产生，抑制了斑马鱼体内脂质过氧化产物的生成，降低了胚胎的细胞死亡率。且与对照组相比，100、200 μg/mL的WBP和FWBP均引起斑马鱼胚胎SOD活性显著升高，50～200 μg/mL的WBP和FWBP均显著提高斑马鱼胚胎CAT和GSH-Px活性。表明麦麸多糖具有较强的体内抗氧化作用，且当质量浓度达到200 μg/mL时FWBP的抗氧化作用显著强于WBP。已有大量研究利用斑马鱼氧化应激模型证实多种植物多糖具有较强的体内抗氧化活性[17,19,22,24]。如邹娅雪等[27]利用斑马鱼模型研究琼胶寡糖的抗氧化机制，发现琼胶寡糖可通过清除体内大量ROS生成和阻止细胞死亡以提高其体内抗氧化功能。先前研究显示，天然活性多糖中的单糖类小分子可通过还原高度氧化性的自由基，使自由基链锁反应终止，清除自由基，以达到抗氧化的效果[28]。麦麸多糖在体外具有羟基自由基和DPPH自由基清除能力已被证实[29]，这可能是WBP与FWBP具有较强的体内抗氧化能力的原因。
多糖的抗氧化作用机制具有多途径、多靶点、多效应的特点。研究发现，多糖可通过提高体内主要抗氧化酶的活性，进而提高机体的抗氧化功能[31]。斑马鱼胚胎的氧化应激和抗氧化防御机制与哺乳动物高度相似[32]，本实验中也发现WBP与FWBP暴露后斑马鱼胚胎抗氧化酶活性显著升高，表明麦麸多糖也可通过提高斑马鱼胚胎中SOD、CAT、GSH-Px等主要抗氧化酶的活性，进而提高其抗氧化功能。Keap1-Nrf2-ARE信号通路是机体抵抗氧化应激关键的防御性转导通路，研究发现，多糖可以通过Nrf2-ARE通路诱导抗氧化酶基因及蛋白表达增加，从而提高其抗氧化作用[31]。如Sun等[32]研究发现，黄芪多糖可通过调节Keap1/Nrf2-ARE信号通路的表达，提高心肌抗氧化能力，减少氧化应激。本实验前期研究也发现发酵麦麸阿魏酰低聚糖可提高敌草快诱导的氧化应激大鼠肝脏和回肠Nrf2的 mRNA和蛋白表达水平以及GSH-Px、CAT和SOD mRNA 表达水平，从而提高大鼠的抗氧化功能[21]，但关于WBP与FWBP发挥抗氧化功能的具体机制还有待于进一步研究。
3.3 微生物发酵对麦麸多糖抗氧化活性的影响
微生物发酵法是生物改性法的一种，是指微生物在适宜条件下，将不能令人满意的底物经过特定的代谢途径分解或转化为相容组分的过程，被认为可以修饰天然多糖的结构特征，提高其生物活性[12,33]。本实验结果显示，与未发酵麦麸多糖组相比，200 μg/mL的发酵麦麸多糖暴露可显著降低斑马鱼胚胎ROS产生量、脂质过氧化率和细胞死亡率，提高仔鱼的抗氧化能力，同时发酵麦麸多糖组胚胎抗氧化酶活性也显著升高。表明经微生物发酵后的麦麸多糖其体内抗氧化活性显著增强。已有研究显示，多糖的抗氧化活性与其单糖组成、分子质量和链构象等结构特征密切相关[34]。Zhang等[35]利用植物乳杆菌NCU116发酵芦笋的研究发现，芦笋多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和半乳糖醛酸组成，芦笋经植物乳杆菌NCU116发酵后其单糖组成发生改变，其中鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸在的比例分别提高了46.70‰、114.09‰、12.75‰，发酵芦笋多糖中检测到葡萄糖醛酸，而未检测到木糖，且发酵后芦笋多糖分子质量从181.3 ku降低到152.8 ku；
且通过DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基清除实验，发现发酵芦笋多糖比芦笋多糖对自由基的清除能力更强。刘燕等[36]利用红曲菌对燕麦进行固态发酵，发现发酵后燕麦多糖的单糖组成发生显著变化，甘露糖和半乳糖比例明显上升，葡萄糖略降低，鼠李糖未检测到，且发酵后红曲燕麦多糖清除羟基自由基和ABTS+自由基的能力及抑制淀粉酶活性的能力均高于未发酵燕麦多糖。本实验前期研究也发现，WBP和FWBP主要由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成，与WBP相比，FWBP中葡萄糖的摩尔比降低了65.31%，木糖和阿拉伯糖的摩尔比分别提高了65.79%和78.18%，且检测到岩藻糖，同时发酵后FWBP(21.19 ku)的分子质量较WBP(52.02 ku)显著降低[31]。已有研究表明，葡萄糖与半乳糖比值较低的多糖具有较高的抗氧化活性[37]，本实验前期研究也证明FWBP的葡萄糖/半乳糖比值低于WBP，这可能是发酵后麦麸多糖具有更强的体内抗氧化活性的原因之一。另外多糖的分子质量与其抗氧化活性密切相关，分子质量的降低使其抗氧化能力进一步增强。此外，有研究显示，富含羟基和糖醛酸的多糖具有更高的抗氧化能力[37,38]，本实验前期对麦麸多糖进行单糖组成分析也显示FWBP中的羟基和糖醛酸含量比WBP中的含量高，这也可能是FWBP比WBP具有较高抗氧化功能的原因之一。
高质量浓度的WBP和FWBP对斑马鱼胚胎的发育具有一定的毒性作用，主要表现为斑马鱼胚胎心率降低、死亡率提高、孵化率降低和初孵仔鱼体长减小。50～200 μg/mL的WBP和FWBP对斑马鱼胚胎发育的影响较小，可显著降低斑马鱼体内的ROS产生，细胞死亡率和脂质过氧化率，提高斑马鱼胚胎中抗氧化酶的活性，从而提高胚胎的抗氧化能力，且FWBP的体内抗氧化作用明显优于WBP。本研究结果表明麦麸多糖具有较强的抗氧化功能，发酵处理可提高其抗氧化作用，可以开发作为抗氧化剂。
猜你喜欢麦麸斑马鱼胚胎小斑马鱼历险记小天使·二年级语数英综合(2021年8期)2021-08-16麦麸喂猪你做对了吗农家参谋(2021年6期)2021-08-03母亲肥胖竟然能导致胚胎缺陷中国生殖健康(2020年5期)2021-01-18麦麸喂猪,你做对了吗？农村农业农民·B版(2019年8期)2019-10-08麦麸喂猪，你做对了吗？农村.农业.农民(2019年16期)2019-01-08母亲肥胖竟然能导致胚胎缺陷中国生殖健康(2018年5期)2018-11-06腰腿痛敷麦麸华声文萃(2018年8期)2018-09-18瓜蒌不同部位对斑马鱼促血管生成及心脏保护作用中成药(2017年6期)2017-06-13油红O染色在斑马鱼体内脂质染色中的应用中国组织化学与细胞化学杂志(2016年4期)2016-02-27DiI 在已固定人胚胎周围神经的示踪研究新疆医科大学学报(2015年10期)2015-12-26