刘艳红，李雪兵，张 慧，潘 晨，王楚楚，陈 蕊，吴海龙
(1.江苏海洋大学 江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏 连云港 222005；
2.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005)
决明子(CatsiatoraLinn)，又名草决明，豆科决明属，其水提物富含萘并吡喃酮类、蒽醌类、萘酚类化合物。决明子具有清肝明目、降血压、降血脂、润肠通便、抗氧化等作用，在食用和药用方面都有较高的价值[1-5]。目前，野生决明子资源已不能满足人们的生产生活需求，而人工种植又存在化肥农药滥用的问题，已有研究发现决明子中检测出18种重金属及有害元素[6]。因此，建立一种环保可持续的绿色生态决明子种植方式显得尤为必要。
大型海藻是海洋植物区系的主要组成部分，其提取物中富含微量元素及大量营养元素、多糖、蛋白质、多不饱和脂肪酸、多酚、植物激素和渗透剂，海藻种类及其生长的季节、地点等环境因素不同，各成分含量也不同[7-8]。目前，海藻已被认定为生物刺激剂来源之一。生物刺激剂是指生物来源的、能够提高植物生产力的配方产品。按原材料来源不同，生物刺激剂来源可分为细菌、真菌、藻类、高等植物、动物原材料及含腐殖质原料。已经被证实可用作生物刺激剂来源的藻类有小球藻、江蓠、海带和马尾藻等[9]。生物刺激剂能够对植物生长产生多种有益作用，如促进白花丹种子萌发和生根，研究表明，添加2.5%海藻提取物处理的白花丹(PlumbagozeylanicaL.)每芽根数、平均根长分别增加1.34倍、1.49倍[10]。海藻提取物也能提高植物整体生长和生产力，在番茄种植中施用海藻提取物的研究表明，番茄花数、花序数、花果比显著增加，果实数和大小明显增加[11-12]。有研究表明，海藻提取物能够有效提高作物抵抗生物和非生物环境因子胁迫的能力，如威氏马尾藻提取物对严重危害棉花作物的害虫红棉球绦虫(Dysdercuscingulatus)具有显著的杀虫活性；
在盐分和干旱胁迫下，对不同小麦品种进行褐藻提取物处理，能够促进小麦根系长度、叶绿素含量、类胡萝卜素含量和组织含水量增加[13-14]。可以看出，将大型海藻提取物应用于种植业能有效提升作物抗逆性,提高产量并改善品质，实现生态种植。
大型海藻提取物在中药种植上的研究和应用目前还较少，其使用效果和作用机制尚不完全清楚。本文以4种经济海藻干品为材料，研究其提取物对决明子种子萌发及幼苗生长的影响，旨在建立一种环境友好型决明子种植方式，为大型海藻资源化利用及决明子生态化种植提供数据资料和理论基础。
1.1 材料
决明子种子购自河北保定安国市万草同源苗木花卉有限公司基地，选择饱满、大小基本一致的决明子种子作为研究对象。以大型海藻干品为海藻提取液材料来源，包括龙须菜、海带、紫菜和裙带菜，分别产自福建莆田、福建霞浦、江苏连云港和辽宁大连。实验所用海藻肥为康朴凯普克有机水溶肥料。
将决明子种子置于直径9 cm培养皿中进行种子萌发试验。于口径6.5 cm、深6.5 cm的21孔育苗盘中进行决明子幼苗培育，栽培基质为草炭、蛭石、椰糠屑、有机质、腐殖酸、珍珠岩组成的有机营养土。
1.2 实验方法
1.2.1 海藻提取液的制备及物理属性测定 将采集的海藻样品用清水冲洗干净，再用纯水清洗3次，置于70 ℃烘箱中干燥至质量不变，将干燥后的海藻于破壁机中打碎成粉末状海藻粉。将100 g海藻粉加入1 000 mL 体积分数50%的乙醇中，使用超声波清洗机超声提取2 h, 4 ℃条件下放置24 h；
于高速离心机4 250 r/min离心15 min，取上清液用Whatman 1号滤纸过滤。下层粉末残渣按上述方法提取一次，合并两次提取滤液。将滤液于旋转蒸发仪蒸发至100 mL，得到1 g/mL的海藻提取液，即质量分数100%海藻提取液。再依次梯度稀释得到质量分数为0.40%，0.20%，0.10%，0.05%的海藻提取液，于4 ℃冷藏，备用。使用EutechTMCyberScan PCD 650多参数测量仪测定各浓度海藻提取液的pH及电导率。
1.2.2 萌发指数测定 将挑选的决明子种子用有效氯质量分数4%的次氯酸钠溶液浸泡消毒10 min，再用纯水清洗3～4次。将处理好的决明子种子置于垫两层滤纸的培养皿中，培养皿提前清洗，并经高压灭菌锅灭菌、烘箱烘干。每个培养皿放置种子100粒，分别加入5 mL质量分数为0.40%,0.20%,0.10%,0.05%的海藻提取液及纯水和海藻肥，每个处理设3个重复。实验期间，每天视蒸发量对各处理组补充相同体积的培养液，确保每粒种子表面湿润，每3天换一次滤纸。培养条件为光照培养箱中昼夜温度25 ℃/20 ℃，光周期14 h/10 h，光强100 μmol/(m2·s)。
每天固定时间记录种子发芽情况，以连续48 h种子发芽粒数不再增加视为种子萌发试验结束。测定发芽势、发芽指数、活力指数、发芽率，相关计算公式如下：
发芽势(%)=
发芽指数=∑(Gt/Dt)，
其中,Gt为t时间内的发芽数，Dt为相应的发芽日数；
活力指数=发芽指数×单株质量(g)；
发芽率(%)=发芽个数/供试种子数×100%。
1.2.3 生长指数测定 决明子种子于海藻提取液中浸泡24 h后种于育苗盘，每天用对应质量分数的处理液浇灌2次，每株10 mL，每个处理设置3个重复，每个重复为3个穴盘，随机排列。实验开始两周后，每个处理选取5株长势一致的决明子幼苗进行以下指标的测定。鲜质量(g)：将决明子幼苗从栽培基质拔出，用毛刷轻轻清除根部表面泥土，用电子天平秤质量；
株高(cm)：直尺测量从露地幼苗直立时幼苗顶部到根部的距离；
主根长(cm)：游标卡尺测量根茎到主根根尖的距离。
取质量为0.1 g的鲜决明子幼苗叶片置于5 mL体积分数95%的乙醇中，4 ℃避光保存48 h提取光合色素[15]。叶绿素a(Chl a)含量和类胡萝卜素(Car.)含量通过测定叶片在470，665，652 nm处吸光度(A470，A665，A652)来计算，公式如下：
叶绿素a含量=13.95×A665-6.88×A652，
类胡萝卜素含量=
称取新鲜决明子幼苗叶片0.1 g,加入5 mL磷酸缓冲液(pH=6.8)，研磨至匀浆，5 000g离心15 min。以牛血清蛋白作标准曲线，采用考马斯亮蓝法测定决明子幼苗叶片蛋白质含量[16]。
1.3 数据处理与统计分析
所有数据用Excel软件进行整理和初步分析，运用SPSS软件进行单因素方差分析和沃勒-邓肯检验，显著性水平P<0.05。对海藻提取液处理的决明子种子萌发及生长数据进行分析，并使用Origin软件绘制柱状图。
2.1 海藻提取液物理属性
4种海藻提取液的部分物理属性见表1。龙须菜提取液、海带提取液、紫菜提取液和裙带菜提取液颜色分别为淡黄、灰绿、深紫和翠绿。随着海藻提取液质量分数的升高，其pH整体呈上升趋势；
电导率呈倍数增加趋势，相同质量分数海藻提取液中裙带菜提取液电导率最高，龙须菜提取液电导率最低。
表1 各质量分数海藻提取液的颜色、pH和电导率对比
2.2 海藻提取液对决明子种子萌发指数的影响
由表2可知，不同质量分数的龙须菜提取液、海带提取液、紫菜提取液和裙带菜提取液均提高了决明子种子的发芽势和发芽指数。随着海藻提取液质量分数的提高，决明子种子的发芽势整体呈现先升高后降低的趋势。各质量分数海藻提取液处理组较对照组而言，均对决明子发芽势有显著促进作用(P<0.05)。0.20%龙须菜提取液、0.10%海带提取液、0.20%紫菜提取液和0.20%裙带菜提取液处理的决明子发芽势最高，分别达30.33%，23.67%，30.30%和31.70%。海藻肥处理的决明子种子发芽势显著高于空白对照组，但显著低于0.20%龙须菜提取液、0.20%紫菜提取液和0.05%～0.20%裙带菜提取液处理组(P<0.05)。
表2 4种海藻提取液对决明子种子萌发的影响
2.3 海藻提取液对决明子种子生长指数的影响
4种海藻提取液对决明子种子生长指数的影响见图1，各提取液对决明子幼苗鲜质量的影响不同。
注：图中数据为平均值±标准差(n=5)，小写字母表示同一列数据的差异显著性(P<0.05)。下图同。
不同质量分数海带提取液处理的决明子幼苗鲜质量显著高于对照组及海藻肥处理组(P<0.05)，其中0.40%海带提取液处理的幼苗鲜质量最高。龙须菜提取液处理组中，0.05%和0.10%处理组的幼苗质量显著高于其他组，0.40%处理组最低。裙带菜提取液处理组中，0.20%处理组显著高于其他组(P<0.05)。紫菜提取液处理组中，0.10%，0.20%，0.40%处理能显著提高幼苗鲜质量(P<0.05)。
海藻提取液处理后，决明子幼苗株高、根长情况如图2所示。海带提取液处理组幼苗株高较空白组和海藻肥处理组显著提高，但各质量分数间无显著差异。龙须菜、裙带菜和紫菜提取液处理组的幼苗株高较空白组无显著差异。0.05%和0.40%海带提取液处理的幼苗根长显著高于空白对照组和海藻肥处理组(P<0.05)，其余处理组幼苗根长较对照组和海藻肥处理组无显著差异。
a 株高
随着提取液质量分数的增大，决明子幼苗叶片的类胡萝卜素含量呈先上升后下降趋势(见图3)。0.10%海带提取液处理组幼苗叶片的类胡萝卜素含量显著高于空白对照组和海藻肥处理组，不同质量分数海带提取液处理间无显著差异。0.05%和0.10%裙带菜提取液处理组的类胡萝卜素含量最高，海藻肥处理组类胡萝卜素含量显著低于其他组。
图3 4种海藻提取液对决明子幼苗叶片类胡萝卜素含量的影响
紫菜提取液处理组的决明子幼苗叶片叶绿素a含量随着提取液质量分数的增高呈现先升高后下降的趋势(见图4)。不同质量分数裙带菜提取液处理组的叶绿素a含量无显著差异。0.20%和0.40%龙须菜提取液处理组的叶绿素a含量显著高于0.05%和0.10%龙须菜海藻提取液处理组(P<0.05)。0.40%海带提取液处理组叶绿素a含量高于其他海带提取液处理组，但与空白对照组和海藻肥处理组无显著差异。
图4 4种海藻提取液对决明子幼苗叶片叶绿素a含量的影响
不同质量分数海藻提取液对决明子幼苗叶片蛋白含量的影响结果(见图5)与叶绿素a的影响规律相似。紫菜提取液处理组的蛋白含量随提取液质量分数的增大呈现先升高后下降趋势。0.10%裙带菜提取液处理组的蛋白含量最高。0.20%和0.40%龙须菜海藻提取液处理组的蛋白含量显著高于0.05%和0.10%龙须菜海藻提取液处理组(P<0.05)。
大型海藻含有丰富的碳水化合物、含氮化合物、色素、脂类化合物、酚类化合物、维生素和海藻药类以及无机成分等，化学组成复杂[17]。有研究表明，红藻提取液中包含了69种化合物，包括植物生长激素、矿物质、蛋白质和多糖等[18]。海藻及其提取物中存在有益植物生长的无机养分、胺类和吲哚类化合物等。在植物有效成分提取过程中，利用提取液显示电信号的特点，通过电导率测定能够反映提取液中有效成分的含量，电导率越高，有效成分含量越高[19]。作物生长的提高是海藻提取液中多种成分交互作用的结果，分馏出的单一组分并不能有效促进生长[12]。基于此，本研究对4种海藻提取液的pH和电导率进行了测定，结果表明不同海藻提取液的电导率差异明显，从高到低依次为裙带菜提取液、海带提取液、龙须菜提取液和紫菜提取液，电导率最高的裙带菜提取液在相同质量分数下较其他海藻提取液对决明子种子发芽势的提升作用最为明显，表明裙带菜提取液可能存在较高的提高决明子种子发芽势的有效成分。而在电导率较高的海带提取液的处理下，决明子幼苗的株高和根长提高最为显著，表明海带提取液中可能存在较多促决明子幼苗生长的组分。
海藻提取液中有效成分促进作物种子萌发和幼苗生长的过程较为复杂，并与海藻提取液的浓度密切相关。种子萌发过程中，在细胞信号转导作用下，一系列蛋白质、酶的代谢受到调控，如可刺激植物生长和发育的赤霉素、脱落酸、细胞分裂素等，这些植物激素与种子的萌发过程息息相关[20]。海藻提取液对决明子种子的引发目的在于促进发芽前代谢活性，增强抗氧化系统活性，并加速膜修复，表现为发芽势、萌发指数和发芽率的提高[21]。本研究结果表明，所用海藻提取液均能提高决明子的发芽势、萌发指数，进而促进种子萌发率的提高。同时，本研究发现低浓度海藻提取液能够提高决明子发芽势和发芽率，而随着海藻提取液浓度的提高，其作用效果先增加进而降低。本研究结果与前人关于海藻提取液对番茄生长促进效应的研究结果一致。在对番茄的研究中发现，低浓度(质量分数0.2%)的海藻提取物处理的种子发芽率较高，平均发芽时间较短，发芽指数和发芽势较高，因此幼苗活力较高，胚芽和胚根长度较长[22]。综上，不同海藻种类和不同浓度对作物种子萌发的作用效应不同。
本研究发现海藻提取液能够有效提高决明子幼苗的鲜质量、株高和根长，这与前人关于大豆、谷物和野芝麻菜研究的作用效果一致。对大豆的研究发现，质量分数0.1%，0.2%，0.3%和0.4%的海藻提取物处理均提高了大豆的株高、叶片数、分枝数和鲜质量等指标[23]；
对谷物的研究发现，低浓度江蓠提取物可显著提高其种子发芽率，促进植株生长[24]。本研究结果表明，不同海藻对决明子幼苗的鲜质量、株高和根长的影响不同，其中海带提取液效果较好，这可能是由于褐藻海带比红藻和绿藻含有更多的多酚。有研究表明褐藻门墨角藻(FucusvesiculosusL.)总酚含量最高，绿藻门石莼(UlvalactucaL.)总酚含量约为墨角藻的1/24，而红藻门角叉菜(Chondruscrispus)总酚含量仅为墨角藻的1/60[7]。对野芝麻菜的研究发现，在中等浓度的海藻提取物处理下野芝麻菜产量最高(1.99 kg/m2)，且含大量的叶绿素、类胡萝卜素、酚类化合物、类黄酮和总营养素[25]。
综上所述，海藻提取液能够有效促进决明子种子的萌发和决明子幼苗的生长，且能提高类胡萝卜素等色素含量，但不同种海藻提取液对决明子种子萌发及幼苗生长的影响不同。紫菜提取液提高决明子种子萌发效果最好，而海带提取液能够显著提高决明子幼苗的株高和根长。同一种海藻提取液中，不同浓度海藻提取液产生的效果也不相同，低浓度海藻提取液能有效促进决明子种子萌发和幼苗生长，质量分数为0.05%～0.20%的海藻提取液促进种子萌发效果较好，随着海藻提取液质量分数的增高，决明子种子萌发和幼苗生长整体表现为先升高后降低的趋势。
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