邴吉帅，王得发，许依能，陈 丽
(1.江苏海洋大学 a.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室；
b.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005；
2.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005；
3.连云港市环境科技服务中心，江苏 连云港 222005)
作为一类高吸水、高保水材料，水凝胶被广泛应用在农业、化妆品、医药材料、食品等领域。传统水凝胶具有强度低、韧性差、吸水速度慢、对环境(温度或pH等)的变化不敏感等缺点。与传统水凝胶相比，天然水凝胶对环境变化敏感，具有较高的生物相容性、保水性、降解性和生物稳定性[1-2]，同时，天然水凝胶可通过负载药物或活性物质，实现止血、抗菌、药物释放，因而在创伤烧伤愈合等领域已得到广泛应用[3-7]。
作为一类重要的天然水凝胶材料，以壳聚糖为基质制备的复合水凝胶受到广泛关注。Patel等[8]用明胶与壳聚糖复合制备了具有促进伤口愈合功能的水凝胶；
Peers等[9]将载药脂质体负载至壳聚糖制备了有利于药物释放的水凝胶；
Hafida等[10]将壳聚糖与聚丙烯酰胺、银纳米粒子结合制备了对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用的复合纳米水凝胶，杀菌率高达99.99%；
Ulu等[11]将壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和MCM-41聚合得到复合水凝胶膜，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和白色念珠菌酵母具有优异抗菌性能，可用于药物递送及伤口愈合材料和吸附材料的生产。但是目前为止，对以壳聚糖和海藻酸钠为基质，以生物活性玻璃为结构调节剂，负载南极磷虾抗菌肽制备海洋多糖复合抗菌水凝胶的研究较少。
壳聚糖和海藻酸钠作为天然亲水性高分子多糖，是食品、医药领域制备功能水凝胶的首选理想材料[8-9,12]，有着很好的应用前景。目前，壳聚糖和海藻酸钠常用于天然水凝胶的制备[13-17]，但该类复合水凝胶生物活性相对较弱。本文利用活性叠加原理，将活性小分子引入到复合水凝胶制品中，试图改善其生物活性。有研究表明，某些天然小分子活性肽具有独特的抗菌机理[18]。南极磷虾抗菌肽作为天然活性肽的一种，具有优良的抑菌作用。在此基础上，本文以海洋多糖壳聚糖、海藻酸钠为主要基质，制备具有较好力学机械性能、生物相容性和持水力的海洋多糖复合水凝胶，并进一步负载南极磷虾抗菌肽，制得具有较好抗菌生物活性的复合抗菌水凝胶，为其在食品、医药领域的应用提供理论依据。
1.1 材料
壳聚糖(CS)、海藻酸钠(SA)、冰醋酸、氯化钙、氯化钠、氯化钾，购自国药集团试剂有限公司，分析纯；
LB肉汤，购自青岛海博生物技术有限公司；
琼脂粉，购自上海桥星贸易有限公司；
生物活性玻璃(BG)，购自浑源骏宏新材料有限公司。南极磷虾抗菌肽为实验室自制；
金黄色葡萄球菌、变异链球菌由江苏省海洋生物资源与环境重点实验室提供。
1.2 设备
真空冷冻干燥机，美国LABCONCO公司；
全波长酶标仪，Thermo Fisher Scientific公司；
Nicolet iS10傅立叶变换红外光谱仪，Thermo Fisher Scientific公司；
JSM-6390LA扫描电子显微镜，日本JEOL；
净化工作台，苏州净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 海洋多糖复合水凝胶制备及条件筛选
(1)复合水凝胶制备。将质量分数为1.5%的海藻酸钠溶液、1.2%的壳聚糖溶液和生物活性玻璃混合均匀，50 ℃水浴下滴加一定量0.3 mol/L氯化钙溶液，搅拌均匀。
(2)海藻酸钠与壳聚糖体积比的筛选。将质量分数为1.5%的海藻酸钠溶液和1.2%的壳聚糖溶液分别按体积比19∶1，18∶2，17∶3，16∶4，15∶5混合，在50 ℃水浴下，向不同混合液分别加入0.5 g/mL的生物活性玻璃，再滴加0.2 mL 0.3 mol/L的的氯化钙溶液，搅拌均匀后注入模具。
(3)生物活性玻璃添加量的筛选。将质量分数1.5%的海藻酸钠溶液和1.2%的壳聚糖溶液按照体积比17∶3混合均匀，50 ℃水浴下，分别加入0，0.25，0.50，0.75，1.00 g/mL的生物活性玻璃，再分别滴加0.2 mL 0.3 mol/L的氯化钙溶液，混匀注入模具。
1.3.2 海洋多糖复合水凝胶成胶时间 复合水凝胶成胶时间的测定采用倒置观察法。将水凝胶混合物放置在室温中，每隔5～10 s倾斜或倒转模具，将水凝胶无法流出模具的时间记为t1，水凝胶完全固化时间记为t2，水凝胶成胶时间为t2-t1[19]。
1.3.3 海洋多糖复合水凝胶扫描电镜分析 海洋多糖复合水凝胶微观形貌分析采用扫描电镜观察。
1.3.4 海洋多糖复合水凝胶性能研究
(1)含水量测定。将不同条件下制备的水凝胶吸干表面水分，称取样品质量为mw，将样品冻干后再称质量，记为md。
含水量(%)=(mw-md)/mw×100%。
(2)溶胀率测定。将不同条件下制备的水凝胶真空干燥后，再在PBS缓冲液中浸泡24 h，至质量不增加(称量3次不变即可)，记为msl[20]。
溶胀率(%)=(msl-md)/md×100%。
(3)力学性能测定。采用质构仪法测定力学性能。将水凝胶用模具做成直径为10 mm、高为5 mm的圆柱体，将水凝胶挤压破裂至最大压力，测量水凝胶的静态压缩模量[19]。
1.3.5 海洋多糖/抗菌肽复合抗菌水凝胶抑菌活性测定 在50 ℃水浴下，分别将质量分数1.5%的海藻酸钠溶液和1.2%的壳聚糖溶液按17∶3体积比混合后，加入0.5 g/mL生物活性玻璃粉体，制备混合胶体6份，再分别加入0，10，20，30，40，50 mg/mL南极磷虾抗菌肽，混匀。最后滴加0.2 mL 0.3 mol/L的氯化钙溶液，制备得到一系列含南极磷虾抗菌肽的海洋多糖/抗菌肽复合抗菌水凝胶，分别记为G0，G1，G2，G3，G4，G5。采用滤纸片法，以抑菌圈直径为指标，分别测定复合抗菌水凝胶对金黄色葡萄球菌和变异链球菌的抑菌活性。
2.1 海洋多糖复合水凝胶成胶时间
海藻酸钠与壳聚糖的体积比对复合水凝胶成胶时间的影响如表1所示。
表1 SA与CS体积比对复合水凝胶成胶时间的影响
在生物活性玻璃添加量为0.5 g/mL、室温条件下，海藻酸钠与壳聚糖体积比不同时，复合水凝胶均可成胶，且随着海藻酸钠体积比例的减小、壳聚糖体积比例的增大，成胶时间呈现先下降后上升状态，当两者体积比为17∶3时成胶时间最短，为60 s左右。因此选择海藻酸钠与壳聚糖最佳成胶的体积比为17∶3。
生物活性玻璃添加量对复合水凝胶成胶时间的影响如表2所示。在海藻酸钠与壳聚糖体积比为17∶3的条件下，生物活性玻璃添加量对复合水凝胶成胶时间不产生明显影响，且在室温下均可成胶，成胶时间约为60 s。
表2 BG添加量对复合水凝胶成胶时间的影响
2.2 海洋多糖复合水凝胶扫描电镜分析
在海藻酸钠与壳聚糖体积比为17∶3的条件下，分别测试了含有0，0.25，0.50 g/mL生物活性玻璃的复合水凝胶的微观表面形态。已知真空冷冻干燥可有效保持水凝胶的网状结构。将所有待测样品真空冻干后进行扫描电镜表面结构表征，结果如图1所示。在放大3 000倍条件下，与不含生物活性玻璃的复合水凝胶(见图1a)相比，含有生物活性玻璃的复合水凝胶(见图1d和图1g)表面网状结构更加紧密，水凝胶分散更加均匀，且随着生物活性玻璃添加量的增大，复合水凝胶分散均匀性、网状结构紧密性进一步增强，团聚现象减少，说明生物活性玻璃的添加可以有效改善复合水凝胶表面网状形态。
a BG添加量0 g/mL，×3 000
2.3 海洋多糖复合水凝胶性能
2.3.1 含水量和溶胀率 海藻酸钠与壳聚糖体积比对复合水凝胶含水量和溶胀率的影响如图2、图3所示。由图2可知，不同海藻酸钠与壳聚糖体积比得到的复合水凝胶含水量均大于90%，整体上含水量状况良好。当海藻酸钠与壳聚糖体积比为19∶1时，所得复合水凝胶的含水量最高，达94.11%；
随着海藻酸钠体积比例的升高、壳聚糖体积比例的降低，复合水凝胶含水量逐渐降低；
当两者体积比为15∶5时，含水量下降至90.34%，这可能是海藻酸钠量的减少影响了凝胶的亲水性，导致复合水凝胶含水量降低。
图2 SA与CS体积比对复合水凝胶含水量的影响
如图3所示，海藻酸钠与壳聚糖不同体积比所形成的复合水凝胶均具有一定的溶胀能力。当两者体积比为19∶1时，所得复合水凝胶溶胀率最大，为65.51%；
随着海藻酸钠体积比例的增大、壳聚糖体积比例的减小，复合水凝胶溶胀率逐渐下降，当体积比减小到15∶5时，溶胀率下降至33.32%。原因可能是随着壳聚糖含量的增加，分子间氢键等作用力增强，交联更紧密，溶胀能力减弱，分子链间的距离较近，在钙离子加入量相同的条件下，更易形成较为致密的网格结构而降低凝胶的溶胀度[21]。
图3 SA与CS体积比对复合水凝胶溶胀率的影响
生物活性玻璃不同添加量对复合水凝胶含水量、溶胀率的影响如图4、图5所示。由图4可知，不同生物活性玻璃添加量所得复合水凝胶产物的含水量均大于93%，均具有较高含水量，但随着生物活性玻璃含量的增加，复合水凝胶的含水量逐渐降低。不含生物活性玻璃的复合水凝胶的含水量为96.69%；
当添加量为0.50 g/mL时，含水量下降为94.11%，添加量增加到1.00 g/mL时，含水量下降为92.94%，降低趋势并不明显。
图4 BG添加量对复合水凝胶含水量的影响
由图5可知，随着生物活性玻璃添加量的增加，所得复合水凝胶的溶胀能力逐渐降低。相关研究证明，水凝胶的含水量、溶胀率跟交联程度有关，复合水凝胶的交联度越高，其含水量、溶胀率越低；
生物活性玻璃的加入，增强了复合水凝胶的交联程度，使复合水凝胶的含水量、溶胀率下降[20]。
图5 BG添加量对复合水凝胶溶胀率的影响
2.3.2 力学性能 如图6所示，海藻酸钠与壳聚糖体积比不同，对复合水凝胶的力学性能影响不同。首先，随着海藻酸钠含量的升高、壳聚糖含量的降低，复合水凝胶压缩模量先增加后减少，在两者体积比从19∶1变为17∶3的过程中，复合水凝胶流动性逐渐变弱，强度降低，形状不够固定。随着两者体积比进一步下降，壳聚糖含量增加，分子链间作用力增强，导致复合水凝胶网络结构更加紧密[22]，压缩模量上升。但是，随着壳聚糖含量进一步增加，复合水凝胶交联度过大，脆性进一步增强，压缩模量降低，力学性能下降。研究表明，在本实验条件下，当海藻酸钠与壳聚糖体积比为17∶3时，所得复合水凝胶的压缩模量最大，达到108.05 kPa。
图6 SA与CS体积比对复合水凝胶压缩模量的影响
由图7可知，海藻酸钠和壳聚糖体积比17∶3条件下，当生物活性玻璃添加量为0时，复合水凝胶的压缩模量为18.72 kPa；
添加量为0.25 g/mL时，压缩模量为97.34 kPa，是未添加生物活性玻璃的5倍多；
当添加量增加到1.00 g/mL时，压缩模量增加到127.24 kPa，是未添加生物活性玻璃的6倍多。随着生物活性玻璃添加量的增加，复合水凝胶的压缩模量明显增加。相关研究表明，生物活性玻璃颗粒耐压程度较高[20]，可提高水凝胶强度，导致压缩模量提升。
图7 BG添加量对复合水凝胶压缩模量的影响
2.4 海洋多糖/抗菌肽抗菌水凝胶抑菌活性
以海洋多糖复合水凝胶负载不同量的南极磷虾抗菌肽，得到一系列海洋多糖/抗菌肽抗菌水凝胶。研究了抗菌水凝胶其对金黄色葡萄球菌、变异链球菌的抑菌活性，结果如图8、图9、图10所示。
a—无菌水，b—CS，c—G0，d—G1，e—G2，f—G3，g—G4，h—G5
a—无菌水，b—CS，c—G0，d—G1，e—G2，f—G3，g—G4，h—G5
图10 样品对金黄色葡萄球菌和变异链球菌的抑菌活性
首先，壳聚糖本身对金黄色葡萄球菌具有一定抑菌性，这与壳聚糖分子结构上的自由氨基、羟基的存在有关。其次，与壳聚糖本身相比，未添加南极磷虾抗菌肽的海洋多糖复合水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑制作用稍有降低，但是随着南极磷虾抗菌肽含量的增加，产物抑菌活性逐渐增强。当南极磷虾抗菌肽的含量为50 mg/mL时，抗菌水凝胶对金黄色葡萄球菌最大抑菌圈直径达25.12 mm；
当南极磷虾抗菌肽的含量为40 mg/mL时，抗菌水凝胶对变异链球菌最大抑菌圈直径达22.02 mm。因此，与复合水凝胶相比，添加南极磷虾抗菌肽的抗菌水凝胶的抑菌活性显著提高，且抑菌活性与南极磷虾抗菌肽的添加量正相关。
通过改变海藻酸钠、壳聚糖、生物活性玻璃的含量可得到性能不同的海洋多糖复合水凝胶。本研究表明,海藻酸钠与壳聚糖体积比的变化对复合水凝胶成胶时间影响较大，生物活性玻璃的添加对成胶时间几乎无影响。条件筛选发现，当海藻酸钠与壳聚糖体积比为17∶3、生物活性玻璃添加量为0.50 g/mL时，所得海洋多糖复合水凝胶的成胶时间最快，约为60 s，含水量为94.11%，溶胀率为44.82%，压缩模量值为108.05 kPa，成胶性较好。同时，研究发现生物活性玻璃有助于复合水凝胶良好网状结构的形成，随着生物活性玻璃含量的增加，所得复合水凝胶的表面网状结构更紧密，分散更均匀，压缩模量增强。但随着生物活性玻璃含量的增加，所得复合水凝胶的含水量、溶胀率呈下降趋势，这与生物活性玻璃可增强复合水凝胶的交联程度有关。另外，通过在海藻酸钠、壳聚糖复合水凝胶的基础上负载具有抑制细菌活性的南极磷虾抗菌肽，得到含有南极磷虾抗菌肽的海洋多糖/抗菌肽复合抗菌水凝胶，并对其抑制金黄色葡萄球菌和变异链球菌的活性进行研究。结果表明，南极磷虾抗菌肽的添加可有效改善复合水凝胶对金黄色葡萄球菌、变异链球菌抑制作用，且抑菌活性与南极磷虾抗菌肽含量正相关。本研究为新型海洋功能性凝胶类抗菌生物材料的开发及其在食品和医药领域中的应用提供了理论依据。
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