李玉芹，齐振华，郝丽阳，樊怡雯
(湘潭大学 化工学院 生物与食品工程系，湖南 湘潭 411105)
产油微藻具有光合固碳效率高、不占农用耕地以及富含胞外多糖和不饱和脂肪酸(如油酸、亚油酸和亚麻酸等)等优势，属可持续生产高品质油脂的理想原料[1-2].但目前微藻油脂工业化应用较为困难，其主要原因是高微藻培养成本及低微藻油脂产率.近年来，国内外研究者围绕如何提高微藻油脂积累开展了大量研究，证实贫营养、低温、高光、高盐、重金属离子等不利培养条件均可诱导藻细胞富集油脂[3].然而，这些非生物胁迫手段利于细胞油脂含量提高的同时也限制了其生长，影响整体油脂产率.探寻全面调控微藻生长代谢及油脂富集策略是解决这一瓶颈问题的关键.
植物激素是调节细胞生长代谢的重要小分子信号物质，研究证实其对微藻生物量积累和胞内油脂富集具有关键调控作用[4].张诚鹏等[5]以水杨酸诱导三角褐指藻，其油脂含量较无水杨酸对照显著提高87.48%；
Contreras等[6]和李悦明等[7]研究发现外源脱落酸对小球藻和微拟球藻中油脂积累也具有明显的促进作用.进一步地，Jyoti等[8]研究报道外源生长素和细胞分裂素能显著提高栅藻中超歧物氧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性，阻止光合色素和蛋白质氧化降解，促进细胞分裂生长和油脂积累；
Guldhe等[9]使用吲哚乙酸显著提高了小球藻中调控油脂合成积累的accD基因表达量，并且上调了核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性，从而使小球藻生物量和油脂含量大大提高；
此外，GA3也可通过刺激酯酶活性和调节细胞内碳流分布来促进微藻生长和油脂积累[10].尽管以上外源植物激素能通过调控微藻胞内油脂合成积累因子促进细胞代谢生长和油脂富集，但其对微藻胞内油脂合成积累的具体调控机制尚不清晰.
胶球藻属单细胞绿藻，在适宜条件下可积累干重58%的甘油三酯，加之全基因组测序已完成，是食源性微藻油脂开发的优良藻株.然而，利用激素诱导强化胶球藻生长和油脂积累鲜有报道.本研究通过在胶球藻不同生长时期外源添加水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)考察其对生物量及油脂富集的影响，并解析最佳激素诱导胶球藻油脂代谢通路上的关键酶活性，为探明植物激素在调控胶球藻生长和油脂积累过程中的作用以及胶球藻油脂规模化生产提供参考.
1.1 胶球藻菌株及种子液制备
胶球藻CocccomyxasubellipsoideaC-169为湘潭大学生物食品系藻菌资源开发与利用实验室保藏菌株.挑取活化单菌落藻细胞接入改进Basal培养基[11]，在(27±1) ℃，光照强度(3 000±200) lux，转速为120 r/min，光暗比12 h/12 h条件下培养168 h获得胶球藻种子液.
1.2 外源植物激素诱导培养胶球藻
在无菌操作条件下，将胶球藻种子液以体积比10%的接种比例接入100 mL Basal培养基，并同时在培养初期分别加入浓度梯度为0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L SA，0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L MeJA，以及0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L ABA.在(27±1) ℃，光照强度(3 000±200) lux，转速为120 r/min，光暗比12 h/12 h下分别培养168 h收获藻液.
同理，在无菌操作下，将胶球藻种子液以体积比10%接种比例接入100 mL Basal培养基，在(27±1) ℃，光照强度(3 000±200) lux，转速为120 r/min，光暗比12 h/12 h下培养168 h至稳定期，分别加入浓度梯度为0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L SA，0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L MeJA，0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L ABA继续培养数天至藻液收获.
1.3 生物量测定
收集1.2节中培养的胶球藻液，在8 000 r/min离心15 min，弃上清获得藻泥.将藻泥放入-80 ℃冰箱内预冻10 h，再放入冷冻干燥机内冷冻干燥至恒重，称重冻干藻粉得生物量.
1.4 油脂含量测定
称取20 mg藻粉，依次加入0.5 mL蒸馏水、1.0 mL无水甲醇和2.0 mL三氯甲烷，漩涡振荡混匀20 min，8 000 r/min离心10 min，收集氯仿层，重复上述步骤5次后，合并所有氯仿层，置于真空干燥器内蒸发至恒重，采用差重法计算油脂含量[12].
1.5 超微结构表征
离心收集激素诱导培养胶球藻液，以磷酸盐缓冲溶液洗涤藻泥.将藻泥悬浮于DMSO溶液中，经诱导、尼罗红染色后采用激光共聚焦对荧光油脂细胞进行成像，激发波长480 nm，发射波长560～615 nm.同步收集激素诱导胶球藻细胞，根据报道方法[11]将藻细胞进行固定、脱水、包埋、聚合、切片后进行透射电镜表征.
1.6 脂肪酸成分测定
参照GB5009.168—2016方法进行脂肪酸定性定量检测.
1.7 胶球藻油脂积累路径关键调控酶活性测定
磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)、3-磷酸甘油脱氢酶(α-glycerophosphate dehydrogenase, GPD)、甘油磷酸二酯酶(glycerophosphodiester phosphodiesterase, GDPD)、苹果酸酶(malate dehydrogenase, ME)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)和单甘油酯酰基转移酶(monoglyceride acyltransferase, MGAT)含量采用植物ELISA检测试剂盒(南京德恒立生物科技有限公司)进行测定.
1.8 数据分析
利用SPSS软件对实验样本相关数据t检验考察组间差异显著性，p<0.01 (**)为组间差异极显著；
p<0.05 (*)为组间差异显著.
2.1 不同外源植物激素诱导对胶球藻生物量和油脂积累的影响
研究报道显示，与高光、缺氮和低温等非生物胁迫相比，诸多植物激素不仅能诱导微藻生长且能促进其胞内油脂富集.如张诚鹏等[5]使用SA诱导三角褐指藻发现，随着SA浓度增大其生物量呈下降趋势，而油脂含量呈增加趋势，在40 μg/mL SA时油脂含量较对照增加了87.48%；
Du等[13]研究发现布朗葡萄藻油脂产量随外源SA浓度增加而增加，在添加20 mg/L SA时达到最大值0.22 g/L，而0.1 mg/L ABA诱导时油脂含量和油脂产量最大为32.33%和0.20 g/L；
此外，Udayan等[14]研究结果显示20 μg/mL MeJA对海洋微拟球藻生长和油脂积累具有促进作用，其生物量和油脂含量分别是对照组的1.37倍和2.26倍，但较高浓度的MeJA则会对微藻生长和油脂积累产生抑制效应.然而，由以上可知，不同藻株对不同植物激素以及不同添加时期响应有所差别，所需激素诱导浓度也不尽相同[4].因此，本研究考察了SA、MeJA以及ABA诱导对胶球藻生物量和油脂积累的影响.
注：本文图中同一生物指标中不同小写字母表示不同SA处理浓度有显著性差异,相同小写字母表示不同SA处理浓度无显著性差异图1 不同生长时期添加SA对胶球藻生物量和油脂积累影响：(a)生长初期；
(b)稳定期Fig.1 The effect of adding SA at different growth stages on the biomass and lipid accumulation of C. subellipsoidea:(a)early growth stage;(b) stable growth stage
不同浓度SA对胶球藻生物量和油脂积累影响如图1所示.由图1(a)可知，在生长初期添加不同浓度SA诱导培养胶球藻，其生物量随SA浓度增加呈先上升后下降趋势，在15 mg/L SA时生物量达到最大值4.5 g/L，是对照组0 mg/L SA的1.09倍，当SA浓度由15 mg/L增至20 mg/L时，胶球藻生长受到抑制，生物量由4.5 g/L降至3.9 g/L.而随着SA诱导浓度增加，胶球藻油脂含量也呈现先增加后降低趋势，10 mg/L SA浓度显著促进油脂积累，油脂含量达到最大值58.8%，是对照组0 mg/L SA油脂含量的1.88倍.随着SA浓度的提高，胶球藻油脂产量变化趋势与油脂含量一致，在10 mg/L SA条件下达到最大值为2.53 g/L，是对照组和其他SA浓度诱导条件下的1.05～1.96倍.由图1(b)可知，在稳定期添加不同浓度SA诱导培养胶球藻，不同浓度的SA对稳定期胶球藻细胞生物量均无显著性影响，而油脂含量和油脂产量均随着SA浓度增加呈先上升后下降趋势.在SA浓度为15 mg/L时，油脂含量和油脂产量最大分别为53.7%和2.27 g/L，是对照油脂含量和油脂产量的1.72倍和1.76倍，较生长初期添加10 mg/L SA获得的最大油脂产量减少了11.45%.综上，SA的最佳添加时间和添加浓度为生长初期添加10 mg/L.
图2 不同生长时期添加MeJA对胶球藻生物量和油脂积累影响：(a)生长初期；
(b)稳定期Fig.2 The effect of adding MeJA at different growth stages on the biomass and lipid accumulation of C. subellipsoidea：(a)early growth stage;(b) stable growth stage
外源MeJA诱导培养基对胶球藻生物量和油脂含量影响如图2所示.由图2(a)可知，在生长初期添加不同浓度MeJA诱导培养胶球藻，其生物量随MeJA浓度增加呈先上升后降低趋势，在10 mg/L MeJA时生物量达到最大值5.2 g/L，较对照和其他浓度MeJA诱导胶球藻生物量分别提高了25.6%、16.07%、1.96%和2.2%.此外，经MeJA诱导的胶球藻油脂含量也随着MeJA浓度提高呈先增加后降低趋势，其在10 mg/L MeJA诱导条件下油脂含量达到最高为52.88%，较对照油脂含量提高了69.2%.而10 mg/L MeJA诱导条件下的胶球藻油脂产量也较对照提高了2.13倍.图2(b)显示胶球藻生长稳定期添加MeJA也显著促进了细胞生长，尤其在5 mg/L MeJA条件下，其生物量达到5.89 g/L，较0 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L MeJA诱导胶球藻生物量分别提高了1.03～1.42倍.而5 mg/L MeJA诱导的胶球藻油脂含量和油脂产量也分别达到最大值60.08%和3.54 g/L，分别是对照胶球藻细胞的1.92倍和2.74倍，与生长初期添加10 mg/L MeJA条件下的最大油脂含量和产量相比增加了14.97%和28.72%.而且生长稳定期添加5 mg/L MeJA诱导的胶球藻细胞油脂和产量较生长初期添加10 mg/L SA诱导的胶球藻细胞油脂含量和产量分别提高了3.4%和39.92%.综上，MeJA的最佳添加时间和添加浓度为生长稳定期添加5 mg/L.
在生长初期添加不同浓度ABA诱导培养胶球藻，发现ABA显著提高了胶球藻细胞生长，其生物量随ABA浓度增加呈先上升后趋于稳定趋势，在4 mg/L ABA诱导下胶球藻生物量达到最大值为6.77 g/L，较无ABA诱导对照提高了63.53%.生长初期添加ABA对胶球藻油脂含量影响也较为显著，在4 mg/L ABA时达到最大值70.25%，在4～8 mg/L范围内趋于稳定.并且4 mg/L ABA诱导的胶球藻最大油脂含量70.25%是对照组的2.25倍.油脂产量也随着ABA浓度的增加呈现先上升后稳定趋势，在4 mg/L ABA诱导条件下油脂产量最大为4.76 g/L，较对照提高了72.89%(见图3(a)).并且在胶球藻生长初期添加4 mg/L ABA诱导获得的最大油脂产量是以上生长初期添加10 mg/L SA和生长稳定期添加5 mg/L MeJA最高油脂产量的2.68和1.91倍.由图3(b)可知，在胶球藻生长稳定期添加不同浓度ABA对其细胞生长无显著促进作用.而油脂含量则随着ABA浓度的提高呈先增加后稳定趋势，在2 mg/L ABA诱导下达到最大值55.5%，在此ABA浓度下油脂产量为2.31 g/L，分别较对照提高了1.78倍和1.79倍，但较生长初期添加4 mg/L ABA诱导胶球藻最大油脂含量和产量分别减少了14.75%和106.06%.与SA和MeJA添加效果相比，生长初期添加4 mg/L ABA所获得的生物量、油脂含量及油脂产率都是最高的.因此，在生长初期添加4 mg/L ABA不仅能显著增强胶球藻生物量，且对其胞内油脂积累和油脂产量提高也具有显著促进作用.
图3 不同生长时期添加ABA对胶球藻生物量和油脂积累影响：(a)生长初期；
(b)稳定期Fig.3 The effect of adding ABA at different growth stages on the biomass and lipid accumulation of C. subellipsoidea：(a)early growth stage;(b) stable growth stage
综合以上，本研究中外源添加SA、MeJA和ABA至不同生长期胶球藻中，发现3种植物激素对胶球藻生物量和油脂积累影响差异显著，与上述报道的微藻生长和积累油脂最适植物激素及使用浓度也完全不同，其中以生长初期添加4 mg/L ABA诱导对胶球藻生物量和油脂积累促进效应最为显著，这说明外源ABA更适宜于调控胶球藻细胞生物量积累和胞内油脂富集.
2.2 植物激素诱导对胶球藻细胞超微结构的影响
由不同外源植物激素对胶球藻生物量和油脂积累影响可知，在生长初期添加ABA能显著增强胶球藻积累胞内油脂.为进一步确认ABA促进胶球藻积累油脂的最佳时间点，对ABA诱导藻细胞进行了微观结构表征.由图4可知，经ABA诱导168 h的胶球藻油脂荧光强度高于ABA诱导24 h、72 h、120 h、120 h和216 h的藻细胞荧光强度，并显著强于无ABA诱导培养24～216 h的胶球藻细胞荧光强度，证实ABA诱导168 h的胶球藻细胞油脂含量最高，这与前面研究结果一致.由ABA诱导胶球藻细胞透射结果可以看出，在无ABA条件下培养24～216 h的胶球藻细胞淀粉颗粒占整个细胞体积的一半以上.而在ABA诱导条件下，随着培养时间的延长，胶球藻细胞淀粉颗粒大小和数量逐渐萎缩，在ABA诱导168 h时，淀粉颗粒萎缩最为显著，以电子密集点形式存在的油脂体聚合成群，占据细胞体积的一半以上，说明脂质含量显著提高，这与激光共聚焦脂质荧光结果显示了一致性，再次证实在生长初期添加ABA能显著促进胶球藻积累胞内油脂.
图4 ABA不同作用时间对胶球藻细胞超微结构的影响(LP:油脂滴；
ST:淀粉颗粒)Fig.4 The effect of ABA on the ultrastructure of C. subellipsoidea cells at different time(LP：lipid droplet;ST:starch granule)
2.3 植物激素诱导对胶球藻脂肪酸组成的影响
尽管ABA诱导有效提高了胶球藻胞内油脂含量，但油脂中脂肪酸类型和组成直接影响其下游生物基产品特性[2].在美国农业部(USDA)发布的《美国人膳食指南》中，建议多食用不饱和脂肪酸含量相对丰富的植物油脂.常见食用大豆油中亚油酸和亚麻酸含量分别占总脂的53%和6.10%；
油菜籽油中亚油酸和亚麻酸含量占比20.40%和7.90%；
花生油中亚油酸和亚麻酸占总脂的28.40%和0.3%[15].可以发现，常见单一食用油很难同时满足富含多种不饱和脂肪酸.
而本研究通过生长初期添加4 mg/L ABA诱导胶球藻油脂脂肪酸组成可知，ABA诱导胶球藻细胞中总脂肪酸含量为90.7%，较无ABA诱导对照组总脂肪酸含量(75.25%)提高了1.21倍，而ABA诱导和对照组细胞脂肪酸均以C16和C18为主，但其各脂肪酸比例显著不同(见表1).另外，经ABA诱导的胶球藻细胞中富含人体多种必需脂肪酸，其中亚油酸和亚麻酸含量分别为30.06%和37.18%，是对照组细胞含量的1.23和1.13倍，且油酸C18∶1比例(15.46%)也显著高于对照组细胞油酸含量(11.24%).整体上，经ABA诱导的胶球藻细胞中不饱和脂肪酸总含量高达84%以上，这略高于Yu等[16]报道的以粗甘油诱导培养胶球藻细胞中的亚油酸(28.78%)和亚麻酸(27.38%)含量，并显著优于Wang等[11]以葡萄糖结合乙酸钠碳源条件下培养的胶球藻中亚油酸(16.50%)和亚麻酸(9.9%)含量以及Peng等[17]以CO2为补充碳源培养的胶球藻细胞中亚油酸(24.73%)和亚麻酸(23.85%)含量，证实ABA激素诱导不仅显著提高了胶球藻细胞中总脂含量，而且能增强人体必需脂肪酸的积累，是食源性油脂原料的理想来源.
表1 外源ABA诱导下胶球藻细胞脂肪酸组成
2.4 植物激素诱导对胶球藻中油脂积累关键调控酶活性影响
为进一步探究外源ABA对胶球藻油脂富集的调控作用，对胶球藻细胞中油脂合成积累路径关键调控酶活性进行了表征.磷酸甘油酸激酶(PGK)是光合自养生物糖酵解和卡尔文固碳途径的关键酶，主要催化1,3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸并产生ATP分子以及光合碳代谢[18-19].研究显示，在异养条件下，小球藻中参与油脂合成的基因上调，而调控光合碳代谢的关键酶(如PGK)几乎完全降解，从而导致藻细胞油脂大量积累[20].另外，Li等[21]也发现三角褐指藻中PGK活性降低导致叶绿体功能受损，促使藻细胞生长和脂质积累.由图5可知，4 mg/L ABA诱导对固碳路径PGK产生显著影响，使其活性显著下调，较对照细胞PGK活性降低了33.46%(p<0.01).因此，可以推测PGK活性降低驱使固定的碳流向油脂合成路径，在一定程度上促进了胶球藻胞内油脂的富集.三磷酸甘油脱氢酶(GPD)和甘油磷酸二酯酶(GDPD)是甘油磷脂代谢路径上的关键调控酶，其分别催化磷酸二羟丙酮生成3-磷酸甘油和水解甘油磷酸二酯生成3-磷酸甘油[22].Wang等[23]和Cheng等[24]分别于莱茵衣藻和栅藻中过表达GPD酶基因，使得藻细胞中油脂含量较对照细胞分别提高了67.5%和1.45倍.Cheng等[24]和Mehra等[25]研究发现外界胁迫条件能使拟南芥和稻谷中的GDPD家族基因表达显著上调，从而促进油脂积累.如图5所示，在ABA激素诱导下，胶球藻细胞中GPD和GDPD酶活性显著增强，其中GPD较对照组增加了14.75%(p<0.05)，其上调表达可促使极性酯向非极性酯转化，3-磷酸甘油大量积累，为TAG生物合成提供足量的前体物质，这也是ABA诱导胶球藻细胞油脂含量提高的重要贡献者.此外，ABA诱导也使得胶球藻细胞中苹果酸酶(ME)活性较对照提高了11.07%(见图5).ME在丙酮酸代谢路径上能够催化苹果酸形成CO2和脂肪酸合成前体物质丙酮酸，对油脂合成积累具有重要的调控作用[26].Xue等[27]研究表明，将苹果酸酶基因导入小球藻细胞中过高表达，ME活性提高3倍的同时油脂含量较野生藻株提高了3.2倍.因而在外源ABA诱导下，ME酶活的增强使得丙酮酸大量积累，为脂肪酸合成提供前体物质.脂肪酸合酶(FAS)是脂肪酸合成关键限速酶之一，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成长链脂肪酸[28].本文研究显示ABA激素诱导胶球藻细胞FAS活性也上调表达，较对照组增加了23.88%(p<0.05)，同时藻细胞中的脂肪酸含量较对照提高了1.46倍，证实ABA诱导可通过调控胶球藻FAS活性来促进脂肪酸合成，这与马淑霞等[29]对裂壶藻报道结果一致.单甘油酯酰基转移酶(MGAT)是植物甘油三酯(TAG)合成途径关键酶，与甘油二酯酰基转移酶(DGAT2)协同促进TAG合成与脂滴扩张[30- 31].Divi等[32]研究得出MGAT活性增强对于烟草叶中TAG含量的增加具有重要的调控作用，而在ABA诱导的胶球藻细胞中MGAT显著上调了1.43倍，其细胞内的油脂滴体积也较对照显著增大，因此可推断MGTA是调控微藻油脂合成积累的关键因子之一.
图5 外源ABA诱导对胶球藻油脂代谢途径关键酶活性的影响Fig.5 Effects of exogenous ABA induction on the activities of key enzymes in the lipid metabolism pathway of C. subellipsoideaol
外源添加4 mg/L ABA诱导胶球藻脂质合成积累结果提示：(1)胶球藻在生长初期添加ABA作用获得最佳生物量、油脂含量和油脂产量分别为6.77 g/L、70.25%和4.76 g/L；
(2)ABA作用诱导了胶球藻胞内多不饱和脂肪酸(如亚油酸和亚麻酸)合成积累，较无ABA作用胶球藻细胞提高了22.8%和17.66%；
(3)ABA作用显著下调了胶球藻固碳路径PGK酶活，同步上调甘油磷脂通路GPD和GDPD、丙酮酸路径ME、油脂路径FAS以及TAG合成路径MGAT活性，消弱光合固碳，使得中心碳代谢流流向脂质路径，加之甘油酯路径的强化，从而协同促进了胶球藻脂质合成积累.然而，仍需考虑以多组学手段揭示ABA诱导藻细胞富集油脂机制，也需评估采用ABA诱导生产功能脂质的经济安全性，以期为进一步拓展食源性胶球藻脂质应用奠定基础.