王娣，陈娟，鲁文静，杨智峰 (陕西省中医药研究院，西安 710003)
熄风止动颗粒由天麻、石决明、菊花、钩藤、全蝎、青葙子、佛手、辛夷、金果榄、胖大海、片姜黄、制白附子、玫瑰花、龙骨共14味中药组成，具有养阴平肝、镇静祛风、涤痰通络的功效，为一种临床经验方，主要用于治疗儿童多动综合征，经临床多年验证疗效显著、副作用小。该方常以汤剂应用于临床，而汤剂存在服用剂量大、不便于携带及长期保存的弊端。颗粒剂具有载药量大、稳定性好、便于携带及保存的优点[1]，可弥补汤剂的不足，因此本研究拟将该方开发为熄风止动颗粒。目前，中药提取工艺的方法主要有正交试验法、均匀设计法、响应面设计法等，其中正交试验法最常用。正交试验受限于因素水平的设定，筛选出来的最佳参数仅限于已设水平的组合，有一定局限性，而人工神经网络(ANN)建模可以打破这一局限[2]。ANN是以生物学中枢神经网络为基本原理，以网络拓扑知识为理论基础，模拟人脑的神经系统对复杂信息的处理机制的一种数学模型，近年来在中药提取工艺方面应用广泛，其中反向传播人工神经网络(BP-ANN)的应用最广泛[3-4]。因此，本试验以天麻素含量和干膏率的综合评分为指标，在正交试验结果基础上联合BP-ANN对熄风止动颗粒的提取工艺进行优化，确定最佳提取条件，为熄风止动颗粒的工业化生产提供实验依据。
1.1 仪器
Agilent 1260系列高效液相色谱仪，配置VWD检测器和Agilent Chem Station工作站(美国安捷伦科技有限公司)；
电热套(北京科伟永兴仪器有限公司)；
电热鼓风干燥箱(中外合资重庆四达实验仪器有限公司)；
KQ-400DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
BT25S型电子分析天平、BS210S型电子分析天平(赛多利斯天平有限公司)；
SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(北京科伟永兴仪器有限公司)。
1.2 药物与试剂
天麻、石决明、菊花、钩藤、全蝎、青葙子、佛手、辛夷、金果榄、胖大海、片姜黄、制白附子、玫瑰花、龙骨均购自广州致信药业有限公司，均符合《中国药典》2015年版有关规定，经陕西省中医药研究院中药研究所杨智峰研究员鉴定均为正品；
天麻素对照品(中国食品药品检定研究院，批号110807-201809，供含量测定用)；
甲醇(HPLC级，Fisher)；
磷酸(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；
水为纯化水。
2.1 天麻素含量测定
2.1.1 色谱条件 Promosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流动相为甲醇-0.05%磷酸(3∶97)，流速0.8 mL/min，检测波长220 nm，理论塔板数按天麻素峰计算应不低于5 000，见图1。
图1 高效液相色谱图
2.1.2 对照品溶液制备 精密称定天麻素对照品2.1 mg至10 mL容量瓶，甲醇定容，再精密量取2 mL至10 mL容量瓶，定容，得含天麻素0.042 mg/mL的溶液。另精密称定天麻素对照品1.44 mg至10 mL容量瓶，甲醇定容，得含天麻素0.144 mg/mL的溶液。
2.1.3 供试品溶液制备 称取熄风止动颗粒处方量药材共9份，按照正交试验表各条件回流提取，提取液用100目筛网过滤，合并提取液。精密吸取所得提取液25 mL置于烘箱中，以60 ℃烘干，加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.1.4 阴性对照品溶液制备 按熄风止动颗粒处方量称取除天麻以外的其他药材，按11倍加水量，回流提取1.0 h，提取2次，提取液用100目筛网过滤，合并提取液。精密吸取所得提取液25 mL置于烘箱中，以60 ℃烘干，加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.1.5 线性关系考察 精密吸取天麻素对照品溶液(0.042 mg/mL)，分别进样1、5、10、15、20、25 μL，测定峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，实际进样量(X，μg)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=2 811.9X-2.154 3(r=0.999 8)。结果表明，天麻素进样量在0.042～1.050 μg范围内与峰面积线性关系良好。
2.1.6 精密度实验 精密吸取天麻素对照品溶液(0.042 mg/mL)10 μL，连续进样6次，得天麻素峰面积的RSD为0.069%，表明仪器精密度良好。
2.1.7 稳定性实验 分别于供试品溶液放置0、2、4、6、8、10、12 h时，精密吸取10 μL进样测定，得天麻素峰面积的RSD为1.12%，表明供试品溶液12 h内稳定性良好。
2.1.8 重复性实验 精密称取同批样品6份，制备供试品溶液，精密吸取10 μL进样测定，得天麻素峰面积的RSD为1.15%，表明该方法重复性良好。
2.1.9 加样回收率实验 精密称取已知含量的熄风止动颗粒共6份，每份2.0 g，分别置于10 mL容量瓶中，精密加入0.144 mg/mL的天麻素溶液0.8、1.0、1.2 mL各2份，定容，按本方法测定，得天麻素平均回收率为98.66%，RSD为1.46%，说明该方法回收率良好。见表1。
表1 熄风止动颗粒中天麻素含量测定的加样回收率实验
2.2 干膏率测定
称取熄风止动颗粒处方量药材共9份，按照正交试验表各条件回流提取，提取液用100目筛网过滤，合并提取液。分别量取50 mL放入已干燥至恒重的蒸发皿内，80 ℃烘箱烘干，于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于用凡士林封口的干燥器中冷却30 min，精密称质量，再于105 ℃烘箱中干燥30 min，再置于用凡士林封口的干燥器中冷却30 min，精密称质量，恒重后计算干膏率。
2.3 药材吸水率实验
称取熄风止动颗粒处方量药材，加水800 mL浸泡 1 h，回流提取 1 h，滤过，量取倾出溶液，计算药材吸水率为339%。因此，考察提取工艺时，第1次提取应该多加水3.4倍量(按干药材质量计，下同)。
采用L9(33)正交试验设计熄风止动颗粒提取工艺，以天麻素含量与干膏率的综合评分为指标，对提取工艺的提取次数、加水量及提取时间等三个因素进行正交试验。正交试验因素水平、试验设计及结果见表2、表3。由表3可知，提取因素对综合评分[综合评分=干膏率(%)×4+天麻素含量(mg)]的影响大小为提取次数>提取时间>加水量；
由表2可知，提取次数的影响差异具有统计学意义。因此，应选择A3B3D2，最佳提取工艺确定为处方量药材加水浸泡1 h后，回流提取3次，第1次提取加水14.4倍量，第2、3次提取加水11倍量，每次提取时间1 h。
表2 熄风止动颗粒提取工艺正交试验因素水平
表3 熄风止动颗粒提取工艺正交试验及直观分析
4.1 BP-ANN模型的建立
随机选取9组正交试验数据中的7组为训练样本，其余2组为测试样本，利用SPSS MODELER 18.0软件建立BP-ANN模型，其中输入层的3个神经元设定为提取次数、加水量、提取时间，输出层的1个神经元设定为综合评分，进行训练模拟。得到最优模型隐含层条件为隐含层1层，神经元10个。结果显示，BP-ANN模型预测所得9组预测值与正交试验数据真实值的平均相对误差为0.783%，拟合系数为0.998，表示该BP-ANN模型训练与预测精度较好，满足试验要求。见表4。
表4 正交试验与BP-ANN模型预测比较
4.2 BP-ANN模型的仿真优化
将原有正交试验中的因素水平增加并进行任意组合，正交试验中提取次数1～3次，设为3个水平；
提取时间为30～90 min，每间隔15 min设一个水平，共5个水平；
加水量为7～11倍加水量，每间隔0.25倍加水量设一个水平，共17个水平。新增的因素水平任意组合可得到135种不同的组合，将这135种组合的数据引入输入层，采用BP-ANN模型进行仿真优化，可得到输出层的135个综合评分，再进行最佳提取工艺的筛选，最终确定熄风止动颗粒的最优提取工艺为处方量药材加水浸泡1.0 h后，回流提取2次，第1次提取加14.4倍量水，第2次提取加11倍量水，每次提取时间75 min，预测得到对应综合评分为142.15。
4.3 验证试验
正交试验优化的提取条件为处方量药材加水浸泡 1 h 后，回流提取3次，第1次提取加水14.4倍量，第2、3次提取加水11倍量，每次提取时间1 h；
BP-ANN模型优化的提取条件为处方量药材加水浸泡1 h后，回流提取2次，第1次提取加水14.4倍量，第2次提取加水11倍量，每次提取时间75 min。分别进行验证试验，平行 3次，结果显示，BP-ANN模型优化的提取工艺综合评分高于正交试验优化的提取工艺，不但可提高提取液中天麻素的含量、节约溶剂用量、缩短提取时间，而且工艺稳定、重复性良好。见表5。
表5 验证试验结果(n=3)
正交试验为一种多水平多因素的实验设计法，特点为均匀分散、整齐可比，广泛应用于中药提取工艺的研究中，但其筛选因素水平和最佳参数组合仅限于实验已设水平的组合，优选结果不会超越所取水平的范围，有一定局限性，而这一局限可以通过人工神经网络建模得以突破[5-7]。ANN是模拟生物神经系统对外界复杂信息处理反馈机制的数学模型，包括径向基网络、BP-ANN、自组织网络、反馈网络等，其中BP-ANN的应用最广泛，由接受信息的输入层、输出信息的输出层和中间隐含层中大量的神经元及相互连接传递的复杂网络组成，具有强大的自主学习、联想储存能力、高效寻求优化解能力和非线性问题拟合能力，鉴于这些优势，BP-ANN在中药提取工艺等许多研究领域均得到了广泛地应用[8-11]。因此，本研究将正交试验与BP-ANN联合应用进行熄风止动颗粒提取工艺的研究。
本研究首先通过传统的正交试验获得熄风止动颗粒提取工艺的数据，然后利用正交试验的数据作为训练样本数据建立BP-ANN的数学模型，再使用已建好的模型进一步优化熄风止动颗粒提取工艺，在不增加实验工作量的基础上获取理想的提取工艺。研究结果显示，正交试验联合BP-ANN得到熄风止动颗粒最佳提取工艺为处方量药材加水浸1 h后，回流提取2次，第1次提取加水14.4倍量(按干药材质量计)，第2次提取加水11倍量，每次提取75 min，不但可提高提取液中天麻素的含量，而且节约溶剂用量、缩短提取时间。
本研究中由于提取时间、提取温度、溶剂用量等因素的单位不相同，数量级相差较大。因此，本研究在使用正交试验的数据进行BP-ANN建模前，将正交试验的数据进行了归一化处理，使数据处于0～1范围内，缩小因数量级差异造成的实验误差。同时，与任何一种数学模型一样，BP-ANN也存在模型结构和函数算法等带来的缺陷，如模型结构中隐含层的层数和每层神经元的数量不仅会影响输出层的结果，还会延长训练时间、出现过度拟合等问题，因此在分析处理具体数据时，应多次尝试选择合适的模型结构和函数算法，并结合具体实验特点加以优化分析，建立更适合的BP-ANN模型。
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