Mounia Lalouly，王祥慧，周佩军，邵琨，安会敏，周全（上海交通大学医学院附属瑞金医院肾移植中心，上海 200025）
供体和受体之间的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen， HLA） 差异与抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection， ABMR） 风险增加相关，并阻碍移植肾长期存活［1］。然而，并非所有活检证实ABMR 相关的移植物功能障碍患者均具有供体HLA 特异性抗体（donor specific antigen， HLADSA）［2］。文献报道了已鉴定出的各种组织来源的非HLA 抗原，对这些靶标的致敏与移植物功能延迟恢复（delayed graft function， DGF）、同种异体移植物损伤和排斥反应有关［3-5］。非HLA 抗体包括次要组织相容性抗原抗体和抗自身组织抗原抗体［5］。移植物受体的非HLA 抗体的效应功能取决于内在特征，如抗体滴度、亲和力和基因型，以及外在因素，如不同的同种异体组织内非HLA 靶抗原的表达密度［6］。然而，了解非HLA 抗体何时以及如何导致同种异体移植物损伤至关重要。
同种异体移植物内皮是移植器官和受体免疫系统之间的第一道屏障。在移植免疫生物学中内皮细胞表达的抗原与非HLA 抗体相关的内皮细胞功能障碍最具有相关性，包括与高凝、活化和通透性增加、凋亡和激活补体相关［7-8］。在针对非HLA 内皮细胞抗原的抗体中，抗血管紧张素Ⅱ 1 型受体的激动性抗体（angiotensin Ⅱ type 1 receptor antibody，AT1R-Ab）是最常报道的与同种异体移植物排斥反应相关的非HLA 抗体［7］，而AT1R 是内皮细胞上表达的一类G 蛋白偶联受体。本文综述了抗AT1R-Ab对肾移植受者的影响及其临床相关的进展，以及抗AT1R-Ab 的复杂特征及其损伤机制。
HLA 配型和HLA-DSA 检测早已被纳入肾移植前免疫评估的临床常规。然而，HLA 全相合同胞肾移植后仍然报道有ABMR 的发生，表明了非HLA抗体在同种异体移植物存活中的重要性［9-10］。在缺乏HLA-DSA 的ABMR 组织学病变的情况下表明了替代作用机制的影响，包括非HLA 抗体的存在及其可能掩盖HLA 特异性IgM 抗体的误导效应［11］。关于移植前或移植后抗AT1R-Ab 水平与肾移植后长期或短期结果的相关性，一些方面观点趋向一致，也有些方面存在相互矛盾的结论。
在目前文献中，肾移植患者中报告的抗AT1R-Ab发生率差异较大，移植前和移植后AT1R 抗体发生率分别为2.1%～59%和3.8%～51.5%［12］。这种较大的差别可能受以下因素影响：研究设计、选择偏倚、研究人群的免疫学背景、抗AT1R-Ab 的阳性临界值、肾脏活检的频率和时间、供体类型和诱导治疗类型等。有研究显示，与DCD 受者相比，无HLA-DSA 的ABMR 活体肾移植受者通常不显示非HLA 抗体阳性，如抗AT1R-Ab［13］。这提示来自活体供体的移植组织细胞可能表达较少的抗内皮抗体表位［14］。
Philogene 等［2］试图明确发生抗体介导损伤的高风险肾移植受者的特征，以及可受益于移植前非HLA 抗体筛查和移植后监测的受者，其结果显示，移植前抗AT1R-Ab 和抗内皮细胞抗体（antiendothelial cell antibodies， AECAs）阳性更多为再次移植、年轻、男性、移植时有FSGS 的受者。使用≥17 U/ml 的界限值，移植前抗AT1R-Ab 阳性的受体在移植后3 个月内血清肌酐升高，并且比抗AT1RAb 阴性患者更早发生移植肾组织异常活检表现［2］。
值得关注的是，当非HLA 抗体与HLA-DSA 同时检测时更有临床意义。如一些研究表明，HLADSA 和抗AT1R-Ab 的联合存在与其中任何一种抗体单独存在相比，可导致更差的结果［6，15-16］。另一方面，Sablik 等［17］报告了有争议的结果，显示了慢性活动性ABMR（chronic active ABMR，cABMR） HLA-DSA阴性患者与cABMR HLA-DSA 阳性患者的肾脏组织学和临床结局时没有发现显著差异。因此，关于ABMR 诊断中是否需要合并存在HLA-DSA 的条件仍有争论。
Lee 等［18］论证，在抗AT1R-Ab ＞9.05 U/ml 时，与移植1 年内活检证实的排斥风险升高3 倍显著相关，但与移植肾失功无关。Deltombe 等［19］发现在移植前抗AT1R-Ab 阳性的肾移植受者中，急性排斥反应发生的趋势未增加，并长期移植物结果无统计学差异，这与他们之前的观察结果矛盾。作者指出抗AT1R-Ab 发生率的差异很可能导致两项研究之间的结果差异［19］。
此外，使用抗AT1R-Ab ≥10 U/ml 为阳性界限值，Lefaucheur 等［7］比较了典型HLA-DSA 介导的排斥反应与抗AT1R-Ab 相关排斥反应的移植受者，结果显示后者的高血压患病率更高，血管性排斥反应合并动脉炎症更多，内皮相关转录水平更高，且同种异体移植肾管周毛细血管缺乏补体沉积。此研究结果也提示，抗AT1R-Ab 水平能区别肾移植排斥反应和移植肾失功的短期和长期（1 ～7 年）高风险受者。
同样，Crespo 等［20］评估了肾移植受者的HLA匹配程度与非HLA 抗体的关系，研究结果显示，在未检测到循环HLA-DSA 的病例中，活检时有相当比例的病例（高达27%）发生了ABMR 损害。此外，研究结果表明移植前抗AT1R-Ab（界限值为10 U/ml）和HLA-DSA 之间存在协同作用，导致组织学ABMR 或促进新生（de novo）HLA-DSA 的产生。此研究还表明，抗AT1R-Ab 与组织学ABMR 的相关性似乎比通过HLA-表位错配分析的不相容性更强［20］。在肾移植受者的前瞻性低免疫风险队列中，Sorohan 等［21］发现移植前形成抗AT1R-Ab 是移植物功能的独立决定因素，但不影响移植后1 年的移植物存活率。
最近的一项荟萃分析研究表明，抗AT1R-Ab 阳性与ABMR、移植肾失功的风险升高显著相关，但在移植肾功能延迟恢复率、T 细胞介导的排斥反应、混合排斥反应等方面无显著相关，且抗AT1R-Ab阳性和抗AT1R-Ab 阴性肾移植患者之间在病死率方面也无显著差异［22］。
在心脏移植领域，一项研究发现，使用常用的酶联免疫试验（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）检测系统，等待心脏移植的患者血清样本中的纤维蛋白形成会产生假性升高的抗AT1R值［23］。作者还认为，在AT1R 检测系统中检测到的许多抗体具有异嗜性，对异种抗原具有反应性［23］。因此，在使用抗AT1R-Ab 水平作为治疗决策的参考时需要谨慎。
值得注意的是，目前文献中检测到的抗AT1RAb 是用商品化或自制的酶联免疫吸附试验测定的，并使用了不同的临界值［24］。为了鉴定最佳阈值，应考虑种族差异和不同个体的免疫遗传背景。此外，大量已发表的临床研究单独检测了移植前预先产生的非 HLA 抗体或术后ABMR 发作时的非HLA 抗体［22］。由于在一些研究中观察到器官移植后抗AT1R-Ab 水平降低［13］，因此了解抗AT1R-Ab 的动力学对于确定受者的免疫风险和对免疫事件的易感性至关重要。上述所有因素可能导致略有不同的结局和解释，使得评价抗AT1R-Ab 和其他非 HLA 抗体在同种异体移植物结局中的相关性更具挑战性。因此，仍需要标准化检测和临床相关临界值对风险患者进行最佳分层。
编码AT1R 的基因位于3 号染色体上，其蛋白质编码区不显示可导致氨基酸序列改变或蛋白质结构改变的多态性。在AT1R 中鉴定出的单核苷酸多态性主要与表达水平相关［25］。然而，在未接受移植的患者中也报告了抗AT1R-Ab 的临床相关性，如先兆子痫、恶性高血压、系统性硬化症、癌症和自身免疫性疾病等［12，26］。因此，抗AT1R-Ab 既往更多被认为是自身抗体，但近年来的研究表明，在移植器官缺血/再灌注损伤的过程中自身抗体也可诱发同种异体免疫反应［12］。
抗AT1R-Ab 的形成涉及一系列复杂且按时间顺序排列的病理生理事件，从内皮损伤开始，内皮损伤产生炎症环境引起B 细胞耐受破坏，最终导致自我耐受丧失［27］。后续的免疫病理是将受体作为新抗原暴露，刺激间接识别途径和刺激自身反应性T 细胞和B 细胞而产生抗细胞和肾组织抗原的抗体［28］。这一过程还包括以下主要事件：刺激辅助性T 细胞17（Th17）分化、表位扩散、交叉反应性、以及同种异体免疫和自身免疫之间的相互作用［12，16］。另一方面，抗AT1R-Ab 引起的肾小管上皮和肾间质细胞局部炎症的增加也可激活抗原呈递细胞，致使 Th1 细胞因子和炎性趋化因子的产生增加，最终导致细胞排斥反应［29］。而且，这种炎症环境可能进一步增加内皮AT1R 的表达，从而维持炎症和随后移植物损伤的恶性循环［23］。
Dragun 等［30］研究表明，抗AT1R-Ab 与位于AT1R 分子胞外第2 个环中的2 个表位（AFHYESQ和ENTNIT）结合。这2 个表位是变构结合位点，有助于激活损伤移植物的信号级联反应。此外，已证明了抗AT1R-Ab 属于IgG1 和IgG3 亚类，可激活补体级联反应［30］。然而，抗AT1R-Ab 并不总是激活经典的补体途径引起移植物损伤，因为在移植物活检中存在微血管炎症，但大多数患者缺乏C4d 沉积，这表明抗AT1R-Ab 通过补体非依赖性和抗体依赖性细胞免疫方式介导移植物损伤［30-32］。Dragun 等［30］研究显示，抗AT1R-Ab 可以诱导内皮和平滑肌血管细胞中ERK 1/2 磷酸化［30］，通过模拟血管紧张素Ⅱ的作用，下游信号通路引发移植物损伤中的促炎和促凝过程。
最近，Catar 等［33］深入探索了靶向AT1R 和内皮素-1 A 型受体（endothelin-1 type A receptor， ETAR）的功能性非HLA 抗体在微血管内皮修复中的全新分子作用机制。在体外，他们证实，从肾移植血管病变患者中分离的抗AT1R-Ab 和ETAR-Ab 抗体通过AT1R 和ETAR 以PI3K 依赖性和细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated kinase， ERK）非依赖性方式激活2 种不同的mTOR 信号复合物（mTORC1和mTORC2），从而可损害内皮细胞修复。
Kill 等［34］研究证实，系统性硬化症患者中的AT1R 和ETAR 抗体可使微血管内皮细胞伤口修复减少，并诱导健康供体的皮肤成纤维细胞产生Ⅰ型胶原蛋白。并且，细胞迁移、伤口修复和胶原蛋白表达的影响取决于AT1R 和ETAR 抗体水平。
Catar 等［33］研究显示将抗AT1R 或ETAR 抗体与其受体连接后，通过mTORC1 激活可诱导信号分子S6 激酶（S6K）的磷酸化。有趣的是， DSA 与HLA-Ⅰ类或Ⅱ类分子连接后诱导的S6K 磷酸化有助于发现心脏移植物中的ABMR，且不受C4d 沉积是否存在的影响［35］。这些研究结果表明，HLA 和非HLA 抗体（如AT1R）在mTOR 信号级联激活中的作用具有相似性，从而导致内皮功能障碍和同种异体移植物损伤。
Catar 等［36］进行了一项有关AT1R 和ETAR 自身抗体在硬皮病肾危象（scleroderma renal crisis，SRC）中致病作用的研究表明，AT1R 和ETAR 自身抗体可通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通路触发内皮细胞增殖。微血管内皮细胞暴露于AT1R 和ETAR 抗体触发cRaf1、MEK、ERK1/2 的激活，然后通过Thr38 的磷酸化激活E26 转 化 特 异 性1（E26 transformation specific-1，ETS-1）转录因子。随后，ETS-1 与组织因子（tissue factor， TF）的启动子结合，触发TF 的表达，而TF作为体内凝血级联的主要启动因子。该研究报告的细胞内信号通路最终导致血管重塑，结合促凝血特性增加，启动了闭塞性血管病变的发生［36］。已有其他研究报道抗AT1R-Ab 诱导TF 可以促进急性移植肾排斥反应［30］。
健康个体也可携带抗AT1R 和ETAR 抗体，这为自身抗体诱导肾损伤机制的研究增加了难度［37］，因而，未来的研究应该评估包括患病者和健康肾脏受者循环抗AT1R-Ab 之间的特性和差异。
目前，抗AT1R-Ab 介导的移植物损伤治疗尚无标准方案。每个移植中心的治疗方案不完全相同，但一般治疗与HLA-DSA相关的ABMR治疗指南相似，包括去除循环中的抗AT1R-Ab 并减少其产生。报告显示，血浆置换可有效消耗抗AT1R-Ab 的功能，然而，血浆置换治疗停止后AT1R-Ab 水平可能发生反弹，并可能导致移植肾排斥反应［38］。Yamada 等［39］报告了2 例血肌酐水平升高、活检显示ABMR 合并抗AT1R-Ab 高水平的病例。在接受血浆置换及IVIG治疗后，抗AT1R-Ab 水平明显下降，并迅速观察到组织学改善，血肌酐也达到了稳定。
与HLA 抗体相比，靶向G 蛋白偶联受体的功能性非HLA 抗体（例如抗AT1R-Ab）不需要整合素诱导细胞内信号。Catar 等［33］研究表明，抗AT1R-Ab可通过直接激活AT1R 和PI3K 通路诱导mTOR 活化，这与HLA 抗体激活通路有所不同。此外，Catar 等［33］的实验表明，抗AT1R-Ab 诱导的mTOR 激活可以被AT1R 特异性抑制剂如缬沙坦完全阻断。
一些临床研究调查了在常规ABMR 治疗的基础上加用血管紧张素受体阻断剂（angiotensin receptor blockers，ARB）阻断AT1R 的效应，例如氯沙坦或坎地沙坦。Dragun 等［30］表明，在抗AT1R-Ab 介导移植物损伤而无HLA-DSA 患者中，血浆置换、IVIG 和氯沙坦治疗可改善移植物存活率和组织学病变，并降低抗AT1R-Ab 水平。另外，病例研究报告描述了1 例肾移植后4 d 出现重度移植肾血管性排斥反应的患者，未发现HLA-DSA，但具有高水平的抗AT1R-Ab。该患者经ATG、血浆置换和口服坎地沙坦治疗后，在清除血管性排斥反应和改善血清肌酐方面显示十分有效［40］。
Carroll 等［41］在一项前瞻性研究中比较了接受围术期血浆置换和坎地沙坦联合治疗的“高风险”患者（抗ATR1-Ab ＞17 U/ml）与在标准治疗下接受移植的“低风险”患者（ATR1 抗体＜17 U/ml）。结果显示，在4 年期间，两组具有相似的排斥率、新发HLA-DSA 发生率和移植物存活率［41］，与之前发表的数据相反，在未使用ARB 的情况下，抗ATR1-Ab ＞17 U/ml 的受者结局劣于抗ATR1-Ab ≤17 U/ml 的受者［42］。
最近，11 例cABMR 合并抗AT1R-Ab 升高的患者接受了抗IL-6 受体抗体托珠单抗作为一线治疗［43］。治疗后6 个月活检显示微血管炎症显著改善，无移植肾小球病、C4d 沉积或IF/TA 进展，中位抗AT1R-Ab水平也显著降低，6 例阴性。托珠单抗最近被用作利妥昔单抗、IVIG、血浆置换治疗无效患者的补救治疗。Lavacca 等［43］研究表明，托珠单抗除了改善血液指标和组织病理结果，还能够降低AT1R-Ab水平。然而，通常成功治疗与抗AT1R-Ab 相关的ABMR 仅限于急性排斥反应，而远期疗效仍然较差［33］。因而，仍需要进行临床试验来精准显示不同治疗方式的益处与区别。
虽然AT1R 的正构配体可用于临床和研究应用，但对AT1R 变构配体的新兴趣揭示了适合药物干预的几个活性位点。Singh 等［44］报告了新型AT1R 变构配体在阻断自身免疫性抗体中的潜在应用，他们基于AT1R 的晶体结构进行了分子动力学模拟研究，揭示了1 个药物可达的包含自身抗体表位的变构隐藏囊袋的存在。利用高通量虚拟筛选获得了该囊袋小分子结合剂的前18 个囊袋，这18 个DCP1 化合物抑制了抗体与AT1R 的结合，并调节了激动剂诱导的AT1R 的钙反应。这证明了发现靶向AT1R 的致病自身抗体抑制剂的可行性，并可作为系统药物开发工作的模板。
基于现有研究资料，AT1R 抗体与肾移植ABMR和移植物失功的风险显著增加相关，然而，非HLA抗体的存在并不是移植的绝对禁忌证，因为并非所有抗AT1R-Ab 阳性的移植受者都会出现移植物功能障碍［19］。抗AT1R-Ab 的存在可能提示既往或持续的组织损伤，并可能有助于识别应当在移植前或移植后接受临床治疗干预的患者，以避免移植物损伤［2，45］。需要进一步的研究来了解肾移植受者自身免疫和同种免疫反应之间的关系，并建立优化的免疫学风险的综合评估体系。
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