尚丽娜，熊学艳，蒋益，戴标，王春来，毛旭华
(1.宁夏吴忠市人民医院儿科，宁夏吴忠 751100；
2.银川市妇幼保健院普儿科，银川 750000；
3.江苏大学附属宜兴医院 a.儿科，b.体检中心，c.检验科，江苏无锡 214200)
发育性癫痫性脑病9型(developmental and epileptic encephalopathy-9，DEE9)是一种以认知功能障碍、发育迟缓、精神异常为特征的早发性癫痫症。该疾病与位于Xq22染色体上的原钙黏蛋白19(Protocadherin 19, PCDH19)密切相关，PCDH19基因可以编码钙依赖性细胞黏附蛋白——PCDH19[1]，该蛋白质主要在中枢神经系统中表达，可以调节神经元细胞增殖、细胞黏附、细胞迁移以及突触传递。基因点突变或基因片段缺失、插入、重复等致病变异形式均可能会导致PCDH19基因功能异常。PCDH19基因突变被认为是DEE9的主要诱因。在DEE9患者中，携带PCDH19基因突变的杂合子女性发病，携带此突变的半合子男性不发病，但含有2种不同遗传特征细胞群的嵌合体男性发生PCDH19基因突变时，会出现DEE9疾病症状[2]。本研究拟调查一DEE9家系的基因型，对患儿及其父母外周血进行外显子组高通量测序，确定患儿遗传学病因，以期提高临床医师对DEE9的认识。
1.1研究对象 患儿女性，3岁5个月，主因“半天内抽搐4次”于2021年10月入住银川市妇幼保健院儿科。患儿入院前半天无明显诱因出现抽搐，表现为意识丧失，呼之不应，双眼凝视、口吐白沫，双手握拳，四肢抖动持续10余秒抽搐自行缓解，无大小便失禁，无发热及头痛。追问病史，患儿1岁5月龄有无热惊厥病史，脑电图异常，经口服左乙拉西坦口服液1.5 mL/次，2次/日抗癫痫治疗，服药1年后无发作故而自行停药。出生史无异常，父母体健，否认近亲婚配及家族遗传性疾病。
入院体格检查T：36.8 ℃，P：90次/分，R：20次/分，神志清楚，咽部充血，双侧扁桃体1度肿大。双肺呼吸音清晰，未闻及干湿性啰音。心率90次，心律齐，未闻及病理性杂音。腹部无异常。生理反射存在，病理反射未引出，四肢肌力正常。入院后辅助检查血常规：血细胞计数8.82×109/L，红细胞4.49×1012/L，血红蛋白128 g/L，血小板247×109/L，淋巴细胞百分比20.3%，中性粒细胞百分比74.7%。C-反应蛋白0.29 mg/L，肌钙蛋白6.45 pg/mL。血糖、肝肾功、电解质、血气均正常。脑脊液常规及生化无异常。颅脑核磁示：右侧额叶近中线处及右侧顶枕叶交界处皮层下DWI异常信号影，不除外缺血缺氧后遗改变。监测脑电图：幼儿期异常脑电监测，检测中1次强直-阵挛发作。
入院后给予苯巴比妥钠，咪达唑仑镇静治疗，吸氧甘露醇降颅压，患儿仍有反复抽搐。结合脑电图结果，抗癫痫治疗的左乙拉西坦口服液调整剂量3 mL/次，2次/日，抽搐次数减少。根据患儿临床特征及辅助检查高度怀疑遗传学疾病可能。为进一步明确诊断，经家长同意抽取患儿及父母外周血2 mL进行全外显子基因测序(委托北京迈基诺基因科技股份有限公司检测)。
1.2方法
1.2.1试剂与仪器 Blood Genomic DNA提取试剂盒(加拿大Norgen Biotek公司)，快速高保真DNA聚合酶(北京索莱宝公司)，DNA凝胶回收试剂盒(南京诺唯赞公司)，Sanger测序试剂盒(美国ThermoFisher公司)。NanoDrop One超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)，GTC96S梯度PCR基因扩增仪、CSL-RVMSCHOICE一体式核酸电泳仪(英国Cleaver Scientific公司)，ABI 3730XL自动测序仪(美国ABI 公司)，Illumina MiSeq测序系统(美国Illumina公司)。
1.2.2样本收集及DNA抽提 用EDTA-K2抗凝血常规真空管采集患儿及其父母外周血样本2 mL,置于-80 ℃保存。按照Blood Genomic DNA提取试剂盒说明书提取外周血DNA，产物用NanoDrop One超微量紫外分光光度计进行质量及纯度检测，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值为1.7～1.8的DNA样本进行后续试验，样本置于-20 ℃保存备用。
1.2.3全外显子基因检测突变位点 患儿及其父母外周血的全外显子基因检测按照参考文献[3]，由北京迈基诺基因科技股份有限公司完成，该公司利用自主研发的GenCap®全外显子基因捕获技术结合Illumina MiSeq测序系统(美国Illumina公司)对目标区域内的23 000种基因进行检测，序列读数与GRCh37/hg19人类基因组组装比对。为保证数据分析的精确性，利用蛋白质功能预测软件REVEL(Rare Exome Variant Ensemble Learner)[4]对变异位点进行注释解读，按照突变形式、人群频率、遗传方式等指标对数据进行过滤，选择与表型相关的致病位点进行后续研究。
1.2.4Sanger测序验证突变位点 对患儿及其父母基因组运用Sanger测序进一步验证全外显子测序所获得的致病位点，引物序列使用在线软件Primer 6.0设计，并由上海擎科生物科技有限公司合成。序列覆盖PCDH19基因(NC_000023.10)第1号外显子中待验证的致病位点及其侧翼序列(PCDH19F：5′-CAAGGTGACCGACTCCAAT-3′，PCDH19R：5′-CGCCTATCTGCTCTCTGTGT-3′)。使用快速高保真DNA聚合酶对目标区域进行扩增。PCR扩增体系为50 μL，包括：ddH2O 40 μL，10×PCR mix 5 μL，PCDH19F 1 μL，PCDH19R 1 μL，dNTP 1 μL，DNA模板1 μL，高保真酶1 μL。PCR反应参数：95 ℃ 2 min；
95 ℃ 20 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循环35次；
72 ℃ 5 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后用DNA凝胶回收试剂盒纯化，利用Sanger测序试剂盒进行测序反应，使用ABI 3730XL自动测序仪进行测序验证。
2.1先证者及其父母的PCDH19基因突变检测结果 全外显子组测序结果发现，患儿基因PCDH19(NM_001184880)在1号外显子处存在c.851_852dupGC变异，且为杂合型，即在基因CDS序列中，第851和852位置处的核苷酸序列GC发生了重复性插入(图1)。患儿父母未发生该突变。
注：Reference，参考序列；
A，先证者测序结果；
B，先证者父亲测序结果及反向互补序列；
C，先证者母亲测序结果；
红色箭头，GC插入突变。
2.2蛋白质翻译预测结果 运用DNAMAN软件对序列进行蛋白质翻译预测，结果发现上述二核苷酸插入导致该基因编码的蛋白质发生移码突变，破坏了第284位氨基酸后的读码框，使第285位氨基酸由T变为A，且在第305位处获得一终止密码子，从而使该蛋白质翻译提前终止(图2)。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南[5]，该变异初步判定为致病性变异(Pathogenic)：该变异为零效变异(移码突变)，可能导致基因功能丧失(极强致病性证据PVS1)。经家系验证分析，患儿父亲该位点无变异，患儿母亲该位点无变异，此变异为自发突变(强致病性证据PS2)。该突变形式在正常人群频率1 000 genomes(千人基因组)、ESP6500(NHLBI Exome Sequencing Project)、EXAC(The Exome Aggregation Consortium)和 EXAC-EAS(EXAC约 4000东亚人数据)数据库中未见报道(中等致病性证据PM2)。经公共数据库查询，基因PCDH19(OMIM：300460)的突变可导致患者发生X染色体相关的DEE9(OMIM：300088)，该疾病特征与本案例先证者表型相符，但突变类型不一样。Sanger测序验证结果证实，受检者PCDH19基因发生c.851_852dupGC杂合突变，父亲和母亲均未发生突变，突变类型属于从头突变，该家系图谱见图3。
图3 该例DEE9患儿的家系图谱
DEE9又称限于女性的癫痫伴智力低下病症(epilepsy with mental retardation limited to females，EFMR)[6]，是一种严重的神经发育障碍疾病，主要由Xq22染色体上PCDH19基因突变导致其编码的PCDH19蛋白在神经元连接、突触膜信号传递等生物过程中的作用失调而致病[7]。PCDH19主要在海马和大脑皮层的Ⅱ/Ⅲ层和Ⅴ层表达，也会与N-钙黏蛋白相互作用，影响突触可塑性[8]。DEE9的主要临床特征包括：婴幼儿时期发病、局灶性癫痫发作、失张力癫痫发作、智力缺陷、全面发育迟缓、全面性强直-阵挛发作、失神发作、全身性肌阵挛发作、发育倒退，其他临床特征还包括自闭症、精神异常。该病症严重影响患儿的身心健康，同时会给患者家庭带来较大的经济负担。
PCDH19基因有6个外显子，其编码的PCDH19包括信号肽、6个保守钙黏蛋白重复序列组成的细胞外结构域、跨膜区域和细胞内C末端结构域。至今为止至少发现约有160多种PCDH19突变类型，包括碱基缺失或插入、剪切位点突变、无义突变、错义突变等，大多数的突变发生在第1个外显子，以新生突变为主。基因突变形式有c.812G>A(p.Gly271Asp)[9]、c.1508_1509 insT(p.Thr504Hisfs Ter19)[10]等，这些突变形式都可能导致PCDH19功能异常。但不是所有的PCDH19基因突变都会导致DEE9，还可能引起睡眠障碍等疾病[11]。PCDH19基因突变形式与疾病的相关性需要临床医生结合受检者的临床表现、家族史及其他检测结果进行综合分析。Depienne等[12]于2009 年报道了1 例男性DEE9患者存在PCDH19基因缺失的体细胞嵌合突变，患者外周血白细胞中整个PCDH19基因缺失，但在患者部分皮肤成纤维细胞中存在PCDH19等位基因，该发现提示了一种致病机理：PCDH19基因突变需要2个细胞群(突变体和野生型)才能发生疾病，而同质细胞群(无论是突变体还是野生型)都不会导致疾病。PCDH19基因突变与X染色体遗传疾病发育性癫痫性脑病密切相关，临床医师应了解PCDH19基因的不同突变形式，提高对DEE9的认识。
在本研究中，对先证者及其父母进行全外显子组测序，结果表明先证者的PCDH19基因在1号外显子处存在c.851_852dupGC二核苷酸重复插入杂合突变，经数据分析发现，PCDH19基因编码区第851～852位的核苷酸GC发生重复插入，该异常插入使得蛋白质翻译发生移码突变而提前终止于305位氨基酸处。PCDH19基因的第1个外显子编码PCDH19蛋白的细胞外重复序列[13]，该结构主要介导细胞之间的黏附作用及信号传导功能，蛋白质翻译的提前终止严重影响其正常生理功能。Lamers等[14]通过监测DEE9小鼠模型中大脑皮质活动的电生理学表征，发现成年早期缺失PCDH19会导致疾病发作。该患儿出生后就有癫痫反复发作、惊厥、脑电监测异常现象，症状与DEE9相一致。由于PCDH19突变所致的DEE9为X染色体相关的遗传疾病，PCDH19基因突变已被认为是DEE9的主要发病原因[15]，当表达野生型PCDH19的神经元和表达突变型PCDH19的神经元共存，或根本不表达，会破坏同质细胞群之间的黏附作用，扰乱细胞通讯，导致疾病发作[16]。高通量外显子测序及Sanger测序证实本研究的先证者是致病杂合突变型，但患儿的父母未发生突变。先证者的PCDH19基因在1号外显子发生c.851_852dupGC p.T285Afs*21从头突变，是DEE9的一种新型突变方式。
随着DEE9患者的数量不断增加，PCDH19基因的突变形式不断被发现，但对该基因突变导致这种综合征的详细分子机制知之甚少。本次研究中，笔者分析了患者的测序数据，后续可进一步通过分子细胞实验评估该PCDH19突变形式对神经元细胞的影响，进而明确该突变形式的具体致病分子机制。综上所述，本研究扩展了PCDH19关于DEE9疾病的突变形式，为遗传咨询、预后检测和产前诊断提供了有力支持。
猜你喜欢证者外显子基因突变外显子跳跃模式中组蛋白修饰的组合模式分析电子科技大学学报(2022年5期)2022-10-29新生儿异常Hb Q的家系分析*临床输血与检验(2022年3期)2022-06-22外显子组测序助力产前诊断胎儿骨骼发育不良中国生殖健康(2020年4期)2021-01-18管家基因突变导致面部特异性出生缺陷的原因中国生殖健康(2020年2期)2021-01-18一个两次多囊肾胎儿孕育史家系的临床分析及遗传咨询郑州大学学报（医学版）(2019年3期)2019-06-031例肝豆状核变性合并杜兴型肌营养不良症及其家系报道传染病信息(2019年2期)2019-05-17外显子组测序助力产前诊断胎儿骨骼发育不良中国生殖健康(2018年4期)2018-11-06基因突变的“新物种”小学生导刊(2018年13期)2018-06-29管家基因突变导致面部特异性出生缺陷的原因中国生殖健康(2018年2期)2018-01-121例AxB血型家系调查遗传方式及血清学特点分析重庆医学(2015年12期)2015-03-05