韩鹏飞 黄贵强
（1大连大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；
2六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州 六盘水 553004）
虫草菌是广义虫草属（Cordyceps s.l.）真菌的统称，其种类繁多且分布广泛，主要寄生于昆虫、少数植物和真菌中［1］。世界上已报道约1 000余种虫草菌，国内报道的虫草菌约100种，虫草真菌能产生多糖、虫草素、虫草酸、超氧化物歧化酶和氨基酸等多种生物活性物质，其中多糖具备抗肿瘤、抗炎、降血脂和清除自由基等功能，在抗氧化方面功能尤为显著，被广泛应用于医疗、饲料、食品等领域［2-6］。
虫草多糖具有较强的抗氧化能力，虫草多糖的抗氧化活性主要是通过清除细胞产生的氧自由基来实现的。对于细胞来说，长期的氧化应激会造成细胞衰老。正常情况下，人的机体会刺激体内的抗氧化系统来应对细胞的氧化，如肝脏中含有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，能够消除体内过多的自由基，维持细胞的平衡［7］。测定其抗氧化能力的方法包括1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率测定、羟基自由基清除率测定、总还原力测定、2,2"-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除率测定等［8］。研究较多的菌株是冬虫夏草（Cordyceps sinensis）、蛹虫草（Cordyceps militaris）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、布 氏 白 僵 菌（Beauveria brongniartii）等［1］［6］。
虫草多糖由于其突出的活性能力，工业化生产虫草多糖就变得尤为重要，而生产的关键不仅在于产量提高，还包括提高虫草多糖的提取率［9-10］。
虫草多糖的提取方法比较多，有热水浸提法、超声波提取法等，通过优化提取工艺，可以提高虫草多糖提取率［11］。目前关于虫草多糖的生产主要通过液态发酵和固态发酵的方式进行［12］。要将虫草多糖应用于食品、医药等领域，还应将提取出的虫草多糖进行纯化和制成药剂等。纯化虫草多糖的方法有蛋白脱除法、大孔吸附树脂法、柱层析法等［13-15］；
虫草多糖的制剂类型有菌粉状、颗粒状等［16-17］。
本文将基于已有的研究报道，对虫草多糖的发酵研究、提取工艺、抗氧化活性测定、纯化和制剂类型等方面进行梳理，为以后工业化生产虫草多糖的最适发酵条件和提取工艺提供参考。
目前野生虫草真菌产生的多糖含量较低，为了提高虫草真菌多糖的表达量，研究人员采用固态发酵和液态发酵方法来提高多糖产量。液态发酵中的液体深层双向发酵是目前能够用于工业化生产的发酵手段，能够较大产量地发酵生产多糖；
虫草真菌的固态发酵研究相对较多，固态发酵的培养基以小麦、大米、玉米等为主，具备成本低廉和低能耗等特点［18］。研究表明，固态发酵和液态发酵方法各有优缺点，其发酵方式对比如表1所示。
表1 虫草真菌多糖的发酵方式对比
对不同的虫草真菌采用适合的方法能够进一步减少生产成本，提高生产效率。
1.1 虫草多糖的固态发酵
以固态培养基代替虫、蛹进行虫草真菌培养，能进一步缩短虫草真菌的生长周期，获得较多的虫草子实体，从而提高活性物质的产量，增大经济效益。关于虫草真菌在固态发酵条件下产虫草多糖的研究相对较少，较难实现产业化，但其发展前景较广阔。根据目前虫草真菌在固态发酵条件下生产多糖的研究表明：以玉米、小麦、大米等产量较高的农作物作为基础培养基进行虫草真菌发酵培养，虫草真菌产多糖的含量相对较高。如王明瑞等［20］利用玉米粉和麸皮为原料制作的固体培养基（玉米粉：麸皮=18 g：2 g）生产虫草多糖，结果表明胞外浸提液中虫草多糖的含量为3.23 mg/mL；
怀美玉等［21］以野黑麦培养蛹虫草，得到子实体中多糖含量为15.41%；
何雯雯等［22］在小麦培养基上发酵蛹虫草，多糖含量高达5.45%；
徐玲等［23］以大米为培养基主要成分培养蛹虫草，虫草多糖产量最高为68.3 mg/g干基质。
在虫草真菌生长的过程中，其产生的多糖一部分储存在虫草的子实体中，另外一部分则通过代谢释放到培养基中，因此虫草多糖可分为胞内多糖和胞外多糖［24］。由于固态发酵的菌丝体与培养基成分无法完全进行分离，因此目前固态发酵研究中测定的虫草多糖含量是胞内多糖和胞外多糖的总含量［20］。
固态发酵方法的培养基质主要是农作物和废渣废料，成本相对较低，而且不易污染，下游处理简易，产物含量高，操作简便；
固态发酵也在某种程度上保留了虫草真菌的自然生长状态，使虫草多糖的产量有所提高，可以给予虫草真菌生产多糖提供研究参考。
1.2 虫草多糖的液态发酵
目前，关于虫草真菌的发酵主要是以液态发酵为主，液态发酵又分为浅层发酵和深层发酵，使用最广泛的是液态深层发酵技术。液态发酵的目的是提高初级代谢产物和次级代谢产物［19］，同时也更容易大批量发酵而应用于工业化生产，液态深层发酵能够完成一次性收集料液，具有缩短生产周期、提高生产效率等特点。
液态发酵能大幅度提高虫草真菌代谢产物的产量，是研究人员普遍使用的方法之一。樊金华等［25］以工业化生产为目的对布氏白僵菌发酵进行单因素优化，得到以氮源为黄豆粉或者玉米粉、碳源为可溶性淀粉、pH值为5.0的培养基进行液态发酵13 d，产生的孢子数量最多，根据布氏白僵菌产生芽生孢子不耐储藏的特性，得到一种最适的产生孢子的方法，为接下来工业化生产奠定基础。Ke BJ等［26］用蝉花进行固态发酵和液态发酵，以腺苷和多糖含量作为指标，得出把0.2%的酵母提取物加入到马铃薯液体培养基中，在100 r/min，24℃条件下培养10 d产生的蝉花腺苷和蝉花多糖含量均高于固态发酵，0.2%的酵母提取物能够提高蝉花的活性物质产量，为蝉花的活性物质工业化生产奠定了基础。胡永乐等［27］以中药厚朴作为培养基成分，利用响应面法优化蛹虫草液态发酵条件生产菌丝体和胞外多糖，在发酵过程中，发现胞外多糖含量受接种量的影响，菌丝体生物量受温度的影响，经过测定胞外多糖和菌丝体含量，最终得到在厚朴添加量3.3%、接种量10.3%、25℃的条件下培养9 d，胞外多糖含量为3.11 mg/mL，菌丝体量为18.81 mg/mL。
虫草真菌的液态发酵研究伴随其代谢产物功能的研究而不断探索，为了进一步提高虫草真菌代谢产物含量，液态深层发酵技术被提出，并应用于实验室和工业化生产当中。对于液态发酵生产虫草多糖的研究成果相对较多，部分成果已实现了量级生产［28］。
液态发酵更容易控制发酵条件，是目前产业化生产的主流研究方向，能够将菌体和发酵基质分离，能为发酵中的虫草真菌精准提供所需化合物，能够定向合成虫草真菌多糖，最大化地利用原料。
虫草多糖在虫草真菌细胞内产生，通过虫草真菌体内的关键酶（半乳糖激酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶）的基因调控［29］，产生虫草多糖，因此需要对胞内和胞外多糖进行提取，才能获得最终的虫草多糖产量。液态发酵条件下的胞外多糖的提取相对简便，即通过发酵液浓缩，Sevage法除蛋白和乙醇沉降，再利用透析法除去小分子糖类（如葡萄糖），即可得到胞外多糖。胞内多糖相对不易获取［27］，目前关于胞内多糖的提取方法主要有：热水浸提法、微波辅助提取法、酶提取法、超声提取法和亚临界水浸提法等，具体如表2所示。
表2 虫草胞内多糖的提取工艺对比
2.1 热水浸提法
热水浸提法［30］是传统的多糖提取方法，利用高温破坏真菌的细胞壁和细胞膜，使细胞内容物释放到胞外，其次利用醇沉等方法得到胞内多糖。热水浸提法具有操作简便、适用范围广、廉价等优点；
但也存在提取时间长、提取不充分的缺点。不过，这种方法依旧是使用较广泛的多糖提取方法之一。
师景双等［31］用热水浸提法对获取虫草多糖进行了研究，最终得到蛹虫草多糖的最适提取工艺，即在菌粉粉碎至80目、料液比为1：20、水浴提取温度为65℃、提取时长2 h、提取次数为3次的条件下，虫草多糖的获得率最高，为10.42%。王小爱等［32］通过对虫草多糖的料液比、提取温度、提取时间、浸提次数的研究，获取了最佳的提取工艺参数，即在料液比为1：40、提取温度为80℃、提取时间为1.5 h、提取2次的条件下，虫草多糖的获得率最高，为74.65 mg/g，比优化提取条件前的虫草多糖提取含量提高了14.96%。黄振峰等［33］通过正交试验对虫草多糖提取工艺的研究，得到热水浸提法的最优参数为：料液比为1：40、提取时间为150 min、提取温度为75℃、提取次数为2次，多糖得率达到14.74%，同时若以冷水和热水交替浸提多糖，多糖得率将再次提高，按照上述的参数进行热水浸提150 min，冷水浸提48 h，多糖得率提高了8%。
2.2 微波辅助提取法
微波辅助提取法［34］是指利用样品或者溶剂中的偶极分子在微波能的作用下，短时间内产生大量的热量，加速了溶剂对样品的渗透，使目的产物溶解于溶剂中，便于提取目的产物。该方法的穿透能力较强，节约溶剂、工艺简单，也可联合其他方法一起使用，被提取物的提取效率较高，后处理也相对方便。
何雯雯等［21］将蛹虫草接种在小麦培养基中发酵生产虫草多糖，然后利用微波提取法提取蛹虫草多糖，首先将蛹虫草子实体进行干燥粉碎，按照料液比为1：50、微波功率为400 W、提取时间为2 h，最终多糖得率为5.45%。郭璐等［35］将忍冬桑黄和蛹虫草共同发酵产出多糖，通过微波提取法提取多糖，提取参数如下：料液比为1：40、温度为70℃、微波功率为600 W、提取时间为1.5 h，多糖提取率为29.18±1.53 mg/g。
2.3 酶提取法
酶提取法［36］指的是利用酶水解真菌细胞壁（主要成分为几丁质和纤维素等），从而使细胞内容物流出，获取目标物质的方法。酶具有高效性、专一性、催化能力强等特性，能够快速地消除细胞壁，使提取时间大幅缩减，但是需要选择合适类型的酶，保证细胞壁能被最大程度地破坏，同时又不损失目标物质。酶提取法还需要严格控制反应条件，进一步提高酶的催化效率。酶提取法比较省时省力，节约时间，但成本相对较高，无法用于大规模的生产，反应条件不易控制。
汪振炯等［37］利用纤维素酶协同微波法研究了蛹虫草多糖的提取工艺，通过多因素优化，最终得出在料液比1：30、温度55℃、pH 5.5、纤维素酶量为1 650 U/g、处理样品44 min的条件下进行微波提取，提取参数为微波功率480 W、提取时间为3.5 min，蛹虫草多糖得率为18.45%。葛静波等［38］通过复合酶对蛹虫草多糖的提取进行了研究，得到的最优提取参数为：料液比为1：20、碱性蛋白酶加入量为3%、淀粉酶加入量为1%、纤维素酶加入量为3%、温度为50℃、酶处理4 h，最终蛹虫草多糖的提取率为18.42%。李慧等［39］采用酶提取法联合超声波提取法进行了虫草花多糖提取工艺的研究，结论为：在料液比为1：50、纤维素酶0.18%、超声温度为53℃、超声功率为175 W、超声31 min的条件下，多糖得率最高，为6.441%。杨（Yang）等［40］通过酶辅助法研究虫草多糖的提取工艺，在料液比为1：20、纤维素酶添加量为2.0%、pH为4.0、酶解温度40℃时，虫草多糖提取率达到5.99%。
2.4 超声提取法
超声提取法［41］指的是在超声波的作用下使细胞壁能够快速破裂，内容物溶解于溶剂中，声波能量转化为热能，能加快内容物溶解，内容物吸收声波能量引起的升温是瞬时的，不会破坏细胞内的提取物。超声波提取法不需加热、提取效率高、节约成本、不会破坏大多数物质的生理活性，具备高效、绿色、经济等优点，能够实现协同萃取，但是会对一些热敏性物质造成损伤。
吕偲丞等［42］通过响应面法来确定超声提取法提取多糖的最优参数，通过多糖含量测定，在超声波功率为1800 W、温度为65℃、超声提取180 min的条件下，虫草多糖提取含量达到31.56%。王振吉等［43］通过研究虫草花多糖的提取工艺，发现在料液比为1：30、超声波功率为300 W、温度为45℃、超声30 min的条件下，虫草多糖的平均提取含量达到3.88%。贾有青等［44］通过对超声时间、超声温度和料液比进行了多糖提取工艺的研究，得出在料液比为1：40、超声温度为50℃的条件下处理30 min，虫草多糖的提取率达到4.85%。
2.5 亚临界水浸提法
亚临界水浸提法［45］指在一定的压力下，使水的沸点升高，由于水是极性化合物，随着温度和压力的升高，水会从极性逐渐变为非极性，随之将非极性的物质溶出，使有效成分得以提取。
杨文雅等［46］利用亚临界水浸提法对虫草多糖提取进行了单因素和多因素研究，结果为：在料液比为1：21、温度为180℃、pH为8.0、萃取13 min的条件下，虫草多糖的提取含量达到7.13%。
目前测定抗氧化活性的方法主要是化学方法，如DPPH法、ABTS法和亚铁离子还原法等。刘城移等［23］以H2O2诱导人正常肝细胞（L-O2）氧化损伤为模型，对比禅虫草的胞内多糖和胞外多糖的抗氧化能力，胞外多糖相比胞内多糖不仅能极大提高细胞存活率，同时显著提高细胞内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶(CAT)的活力，降低细胞活性氧（ROS）水平，使细胞的抗氧化能力加强，氧化损伤降低。
3.1 ABTS自由基清除能力测定
ABTS法测定自由基是一种使用较广泛的方法，主要是通过ABTS与过硫酸钾反应生成稳定存在的且呈现为蓝绿色的ABTS自由基，在734 nm下具有较大的吸收能力，通过测定物质的加入，若ABTS自由基的吸光度值降低，则表明该物质具备抗氧化能力，吸光度值降低得越大，抗氧化能力就越强［47］。
3.2 DPPH自由基清除能力测定
DPPH是一种比较稳定的物质，用乙醇配置成溶液以后，溶液呈现为紫色，若加入抗氧化活性物质，DPPH会捕捉一个电子与游离电子进行配对，使得溶液由紫色转变为无色，在517 nm处的吸收较强，而DPPH转变为无色的量与抗氧化物质的量呈线性关系，能够较容易地判断该物质的抗氧化能力强弱［48］。
3.3 羟基自由基（·OH）清除能力测定
羟基自由基清除能力测定是通过芬顿（Fenton）反应中二价铁离子与过氧化氢反应生成羟基自由基，羟基自由基会与水杨酸溶液反应生成2，3-二羟基苯甲酸，在510 nm下有特殊吸收值，通过抗氧化物质对羟基自由基的消除，能够减少2，3-二羟基苯甲酸的生成，从而测定出该物质的抗氧化能力［49］。此实验中需注意：过氧化氢或者水杨酸应最后加入，以减少实验误差。
3.4 超氧自由基（O2-·）清除能力测定
超氧自由基清除测定包括邻苯三酚自氧化法和核黄素-氮蓝四唑（NBT）光还原法。核黄素-NBT光还原法［50］原理是黄嘌呤在有氧条件下，被黄嘌呤氧化酶催化产生超氧自由基，超氧自由基会与NBT结合使溶液呈现为蓝色，在560 nm下具有较大吸收值，抗氧化物质的清除能力与溶液的颜色成反比。
邻苯三酚自氧化法［51］的原理是在碱性条件下，邻苯三酚能够自我氧化，生成有色产物和超氧自由基，通过加入抗氧化物质，邻苯三酚自氧化速率降低，产生的有色产物减少，在325 nm下有较大吸收值，进而测定出该物质的抗氧化能力。该方法对温度和pH较为敏感，而pH与温度的相关性较大，因此在实验过程中需要严格控制温度。
4.1 虫草多糖纯化方法
4.1.1 蛋白脱除法
蛋白脱除纯化法是指除去虫草粗多糖中的蛋白质杂质，达到虫草多糖纯化的一种方法。目前蛋白脱除纯化法主要利用是Sevage试剂（由氯仿和正丁醇组成）进行蛋白脱除，Sevage试剂会使虫草多糖中的蛋白质变性，形成不溶于醇和水的沉淀，但是此方法对虫草多糖的损耗率较大，且试剂具有一定的危险性［14］。
4.1.2 大孔吸附树脂法
大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂,具备吸附和分子筛分离等功能,具有较好的吸附分离性能,不会影响物质活性，分离效果较好，是目前常用的分离纯化的方法之一［15］。
4.1.3 柱层析法
柱层析法是根据样品中成分与硅胶物质的吸附力不同或者样品中成分大小不同进行分离纯化的方法，如DEAE-52柱层析和交联葡聚糖（Sephdex）-100葡聚糖凝胶柱层析等。此方法具备操作简便、可重复使用和分离效果较好等特点，也是目前分离纯化常用的方法［16］。
4.2 虫草多糖制剂类型
由于虫草多糖具有较广泛的活性功能，能被应用于医疗行业。但虫草多糖产量较少，因此为了最大化利用虫草多糖，可根据不同目的将虫草多糖制备成不同的制剂类型，如液体状、菌粉状和颗粒状等［17-18］。合理化地将虫草多糖制备成各种试剂类型，不仅能实现资源最大化利用，还能降低成本。
综上可知，目前关于虫草多糖发酵生产的研究大多只应用于实验室阶段，而要满足工业化生产条件、大批量获取虫草多糖的研究报道相对较少，且以天然产物作为主要的发酵培养基成分的比例不高，进一步提高了发酵的成本，也是无法进行工业化生产的限制条件之一。虫草真菌的固态发酵和液态发酵对于不同的菌株会得到不同的发酵产物和产量。根据目前的研究报道，液态发酵的多糖含量高于固态发酵，但是固体发酵的成本要低于液态发酵。由于菌株的不同，所得到的结果也不相同，因此结合液态发酵和固态发酵的手段来提高虫草多糖的产量，也将是未来研究虫草真菌生产虫草多糖的方式方法。
固态发酵和液态发酵都可以提高虫草真菌多糖的产量，但还须要对虫草多糖的提取工艺进行优化，获得最佳的提取工艺。提取工艺的选择和应用不能破坏多糖结构、影响多糖活性，提高多糖的抗氧化、抗肿瘤等生物活性。虫草多糖的纯化应该尽可能地去除杂质，同时减少多糖损失，提高虫草多糖纯化率，因此对于纯化方法应该不断地去探究，可结合多种纯化方法，以期达到最大化纯化效率，如结合蛋白脱出法和大孔树脂吸附法来纯化虫草多糖。虫草多糖的制剂类型由使用目的决定，能提高多糖利用率，降低制剂成本。
随着新型技术的开发和应用，虫草多糖的提取率大幅提升，加快了虫草真菌产生的活性物质的研究，也为中药工业化生产奠定了基础。但工业化生产仍需考虑成本、操作难度、使用条件等问题，因此发酵生产方法的融合将是未来进一步研究虫草多糖生产的方向。
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