唐 乐， 李 宏， 何丽丽， 牛海文， 罗 琴
新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经内科，乌鲁木齐 830011
流行病学调查发现，中国肺癌的死亡率较以往30年增加了约464.84%[1]。尽管在肺癌研究及诊疗方面取得了许多进展，但仍有较多患者确诊时已处于临床终末期。大约80%～85%肺癌患者的病理类型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，研究NSCLC能明显改善肺癌患者群体临床预后。microRNA(miRNA)是一类能与目标基因靶点序列相互结合，作用类似于siRNA的内源性小分子非编码RNA，其可抑制目标靶基因的表达[3]。miRNA由高等真核生物基因组编码，可靶向约60%的基因组基因。研究miRNA对NSCLC有重要临床意义[4]。既往研究发现，miR-19b-3p与包括NSCLC在内的多种癌症相关，可通过多种信号途径发挥抑癌或促癌作用，但其在恶性肿瘤中的表达趋势及作用不一，分子机制存在争议[5-6]。
竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，是一种能够竞争性结合RNA的作用元件。长链非编码RNA(lncRNA)可竞争性结合miRNA并且充当ceRNA调控mRNA的表达[7]。转移相关性肺腺癌转录本1(MALAT1)是NSCLC中研究最为广泛的一种癌类lncRNA，其在包括NSCLC在内的多种恶性肿瘤中表达明显增高[8]。例如，MALAT1在缺氧条件下表达增高并促进乳腺癌细胞增殖、分化及血管形成，此效应主要由缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)介导[9]。最近有研究表明，缺氧诱导下的血管内皮细胞中miR-19b-3p和HIF-1α之间存在靶向关系，MALAT1可海绵吸附miR-19b-3p，且使HIF-1α呈缺氧时间依赖性升高[10]。本课题组对比NSCLC癌组织与癌旁组织发现，MALAT1在患者癌组织中高表达，而miR-19b-3p低表达。然而目前在对NSCLC的研究中，尚未明确MALAT1/miR-19b-3p/HIF-1α三者之间是否存在ceRNA调控网络。本文旨在研究MALAT1是否与miR-19b-3p之间存在海绵吸附作用并调控HIF-1α/VEGF分子轴参与NSCLC发病机制。
1.1 研究对象及材料
选取2019年1月～2019年12月期间新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经内科收治的经手术病理确诊为NSCLC的肺癌组织及对应癌旁组织标本各15例。其中男性9例、女性6例，年龄55～73岁，平均年龄(63.27±5.65)岁；
鳞癌4例、腺癌11例；
临床分期Ⅰ期2例、Ⅱ期4例、Ⅲ期7例、Ⅳ期2例(以上临床标本使用均获知情同意)。人正常支气管上皮细胞系16HBE及人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299、NCI-H1650、SPC-A1、A549细胞来源于普诺赛生物公司；
MALAT1、HIF-1α、VEGF引物，miR-19b-3p模拟物(mimic)及其阴性对照(NC mimic)，MALAT1 siRNA(si-MALAT1)以及阴性对照(si-NC)由吉玛基因公司构建；
Anti-HIF-1α抗体由Abcam公司提供，Anti-VEGF抗体由博奥森公司提供，二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)和山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)购自Abcam公司；
CCK-8细胞增殖试剂盒由全式金生物公司、Transwell小室由Corning公司、凋亡试剂盒由BD公司提供。
1.2 细胞培养和转染
细胞在完全F-12K培养液，37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。根据转染说明书进行转染实验。分别设miR-19b-3p mimic组、NC mimic组、si-MALAT1组、si-NC组、空白对照组，转染后培养细胞48 h。
1.3 RNA提取和实时荧光定量PCR
采用Trizol从组织或细胞中提取总RNA，用5X All-In-One RT MasterMix进行RNA逆转录，用miRNA荧光定量PCR试剂盒进行miRNA逆转录，以cDNA为模板在荧光定量PCR仪(ABI 7500 FAST)上进行qRT-PCR反应。MALAT1、HIF-1α、及VEGF使用GAPDH为内参，miR-19b-3p使用U6为内参。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列详见表1。
表1 引物序列表Table 1 List of primer sequences
1.4 蛋白质免疫印迹检测
按1.2项转染分组，按Western blot法将细胞提取的总蛋白凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上。一抗兔抗HIF-1α抗体、兔抗VEGF抗体孵育过夜，二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)室温孵育1 h，ELC化学发光显影。β-actin作为内参对照。Image J软件分析蛋白条带灰度值。
1.5 CCK-8检测细胞增殖
按1.2项转染分组后，按CCK-8方法测定细胞的增殖，各组重复5孔。每孔加入100 μL 10% CCK-8试剂，1 h后用Bio-Rad xMarkTM酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)值。
1.6 细胞周期检测
按1.2项转染分组后，重悬细胞过200目筛网制成单细胞悬液。4℃避光孵育30 min。用流式细胞仪检测红色荧光及光散射(激发波长488 nm)。
1.7 细胞凋亡检测
按1.2项转染分组后，吸出细胞瓶内培养液及2次PBS洗涤液至离心管内(内含凋亡或坏死细胞)，胰酶消化、离心、重悬、过筛，制备单细胞悬液。加入5 μL Annexin Ⅴ-PE试剂和10 μL 7-AAD试剂，在4℃条件下使处理后的单细胞悬液避光10 min。采用LSRFortessa流式细胞仪在30 min内尽快检测细胞凋亡比率。
1.8 细胞迁移及侵袭检测
按1.2项转染分组后，重悬并调整细胞悬液至5×105mL；
将基质胶包埋在Transwell小室底部中央；
取100 μL细胞悬液接种至无基质胶的Transwell小室(迁移实验)及含有基质胶的Transwell小室(侵袭实验)中；
在下室加入600 μL完全培养液，各组3个重复孔，48 h后弃小室内上清并拭去小室上层内的细胞及基质胶，甲醛固定小室下层穿膜细胞，用Giemsa染液染色，取3个显微镜随机视野计数迁移和侵袭细胞数。
1.9 统计学分析
2.1 生物信息网站靶向预测结合位点
利用生物信息学在线网站lncRNASNP2(http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP/)及targetscan(https：//www.targetscan.org/)预测了miR-19b-3p与MALAT1及HIF-1α之间均有互补结合位点。如图1。
图1 miR-19b-3p与MALAT1、HIF-1α靶向结合预测位点Fig.1 Predicted targeted binding sites between MALAT1，HIF-1α and miR-19b-3p
2.2 MALAT1、miR-19b-3p在NSCLC癌组织及癌旁组织中的差异表达
qRT-PCR检测发现，MALAT1在15例NSCLC癌组织中平均相对表达量为(2.649±0.724)，对应邻近癌旁组织中平均相对表达量为(1.006±0.484)(P<0.05，图2A)。miR-19b-3p在15例NSCLC癌组织中平均相对表达量为(0.400±0.113)，而在邻近癌旁组织中平均相对表达量为(1.028±0.164)(P<0.05，图2B)。Pearson相关性分析显示MALAT1与miR-19b-3p表达呈负相关，r=-0.8969(P<0.01，图2C)。
A：MALAT1的相对表达量；
B：miR-19b-3p的相对表达量；
C：MALAT1和miR-19b-3p的相关性分析图2 MALAT1和miR-19b-3p在非小细胞肺癌组织及癌旁组织中的相对表达量Fig.2 The relative expression levels of MALAT1 and miR-19b-3p in NSCLC tissue and paracancerous tissue
2.3 MALAT1、miR-19b-3p在NSCLC细胞系及正常支气管上皮细胞系中的差异表达
qRT-PCR检测发现，与人正常支气管上皮细胞系16HBE相比，MALAT1在人NSCLC细胞系NCI-H1299、NCI-H1650、SPC-A1、A549中相对表达增加，其中A549平均相对表达量较高为(6.815±1.031)(P<0.05，图3A)，而miR-19b-3p在人NSCLC细胞系NCI-H1299、NCI-H1650、SPC-A1、A549中相对表达减少，其中A549平均相对表达量较低为(0.359±0.076)(P<0.05，图3B)。综上，MALAT1、miR-19b-3p在NSCLC细胞系A549中表达差异显著。
A：MALAT1的相对表达量；
B：miR-19b-3p的相对表达量；
与16HBE细胞比较，*P<0.05图3 MALAT1和miR-19b-3p在NSCLC细胞系及16HBE细胞系内的相对表达量Fig.3 The relative expression levels of MALAT1 and miR-19b-3p in NSCLC and 16HBE cell lines
2.4 过表达miR-19b-3p及敲除MALAT1对A549细胞中miR-19b-3p、MALAT1、HIF-1α、VEGF基因表达的影响
qRT-PCR结果显示，NC mimic组、si-NC组与Control组之间miR-19b-3p、MALAT1、HIF-1α、VEGF基因的RNA表达差异均无统计学意义。miR-19b-3p mimic组细胞中miR-19b-3p表达升高，表明转染有效，同时转染后A549细胞内MALAT1、HIF-1α、VEGF的RNA水平显著下降(均P<0.05)。si-MALAT1组细胞中MALAT1表达降低，同时转染后A549细胞中的miR-19b-3p水平显著上升，HIF-1α、VEGF基因的RNA水平均显著下降(均P<0.05)。Western blot检测结果显示，NC mimic组、si-NC组与Control组之间HIF-1α、VEGF蛋白表达差异无统计学意义，而miR-19b-3p mimic组、si-MALAT1组相对于其他对照组中HIF-1α、VEGF水平均显著下降(均P<0.05)。见图4。
1：Control；
2：NC mimic；
3；
miR-19b-3p mimic；
4；
si-NC；
5：si-MALAT1；
A：转染后miR-19b-3p的RNA相对表达量；
B：转染后MALAT1的RNA相对表达量；
C：转染后HIF-1α的RNA相对表达量；
D：转染后VEGF的RNA相对表达量；
E：转染后HIF-1α的蛋白相对表达量；
F：转染后VEGF的蛋白相对表达量；
G：HIF-1α、VEGF的Western blot图；
*P<0.05图4 转染miR-19b-3p mimic及si-MALAT1对A549细胞miR-19b-3p、MALAT1、HIF-1α、VEGF基因相对表达水平的影响Fig.4 Effect of transfection of miR-19b-3p mimic and si-MALAT1 on the relative expression levels of miR-19b-3p，MALAT1，HIF-1α and VEGF gene in A549 cells
2.5 过表达miR-19b-3p后A549细胞的增殖、细胞周期、迁移侵袭、凋亡水平变化
如图5所示，转染miR-19b-3p mimic后，NC mimic组与Control组之间增殖水平、细胞周期分布、细胞凋亡率及细胞迁移侵袭水平差异均无统计学意义。而miR-19b-3p mimic组中，转染后的A549细胞的增殖活性下降；
G2/M期细胞比例下降及G0/G1期细胞比例有所上升；
细胞凋亡率增加；
细胞迁移及侵袭细胞数水平明显下降(均P<0.05)。
1：Control；
2：NC mimic；
3；
miR-19b-3p mimic；
A：转染对细胞增殖的影响；
B：转染对细胞周期的影响；
C：转染对细胞凋亡的影响；
D：转染后细胞迁移及侵袭细胞计数变化柱状图；
E：细胞迁移及侵袭实验镜下图(标尺=50 μm)；
*P<0.05图5 过表达miR-19b-3p后A549细胞的增殖、细胞周期、凋亡、迁移、侵袭水平变化Fig.5 Changes in A549 cells proliferation，cell cycle，apoptosis，migration and invasion after overexpression of miR-19b-3p
MALAT1最早发现于对NSCLC的研究，在其细胞及组织中高度表达，被视为NSCLC预后标志物[11]。现有研究证实MALAT1与肺、乳腺、结肠、膀胱、肝脏和胰腺等多种实体恶性肿瘤显著相关，被认为是促癌类的lncRNA[12-13]。既往有研究发现MALAT1与缺氧诱导因子(HIF)通路似乎密切相关[14-15]。然而MALAT1参与NSCLC的具体分子机制却不明确。长链非编码RNA(lncRNA)是不具备编码蛋白质功能的长核糖核苷酸链(>200 nt)RNA，但其通过不同机制对细胞内生物活动起到多重调节作用[16]。lncRNA的重要调节机制之一是充当内源竞争性RNA(ceRNA)通过海绵吸附miRNA来调节后者生物学功能[17]。在一项关于乳腺癌的研究中发现[18]，MALAT1可以被HIF-1α和HIF-2α转录激活，并与miR-3064-5p相互靶向结合促进乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖和迁移。在另外一项缺氧处理的人脐静脉内皮细胞研究中，敲低MALAT1可提高细胞中miR-19b-3p水平，并抑制HIF-1α的表达以及细胞的凋亡、自噬和炎症反应，HIF-1α的过表达可逆转MALAT1敲低的影响[10]，这与本研究结果一致。本研究在NSCLC患者外周血高通量测序及NSCLC患者癌组织及NSCLC细胞系中发现MALAT1表达量升高，而miR-19b-3p表达量显著减少；
生物信息学分析预测MALAT1与miR-19b-3p存在靶向结合位点，以上提示MALAT1或许充当miR-19b-3p的ceRNA影响后者的生物学效应；
本研究通过在A549细胞中过表达miR-19b-3p及敲除MALAT1亦验证了此海绵机制的可能性。同时，转染miR-19b-3p mimic后的A549细胞内MALAT1、HIF1α、VEGF下调显著，并且A549细胞的增殖能力、分裂能力、迁移及侵袭能力均有所下降，凋亡率增加。本研究结果提示MALAT1可通过海绵吸附miR-19b-3p，调节下游HIF-1α/VEGF分子轴来影响NSCLC细胞的生物学功能。
miRNA调节内源靶基因转录后表达水平，与真核细胞分化、增殖、凋亡、转移等多种生物学行为密切相关。已发现多个miRNA作为肿瘤抑制因子或癌基因在NSCLC中异常表达[19]。miR-19b-3p是从miR-19b前体的3′端臂加工而成，其表达异常参与多种疾病病理生理过程。Zhao等[20]发现miR-19b-3p可靶向PTEN抑制人髓核细胞凋亡缓解椎间盘的退行性变。Su等[21]通过RNA测序筛选和qRT-PCR验证发现miR-19b-3p可作为急性心力衰竭的新型预后生物标志物。另外，miR-19b-3p表达异常参与多种恶性肿瘤疾病，例如食管癌[22]、胃癌、肺癌[23]、乳腺癌和淋巴瘤[24]等。在一项乳腺癌的研究中，miR-19b-3p通过调节PI3K/Akt途径抑制乳腺癌细胞增殖并可逆转塞卡替尼耐药性[6]。Zhang等[25]采用高通量miR测序方法和qRT-PCR证实miR-19b-3p在3种胃癌细胞中表达显著下调。Wei等[5]发现，miR-19b-3p负调节NRP1抑制胃癌细胞生长、迁移和侵袭，过表达NRP1可逆转miR-19b-3p的负向调控作用。本研究生物信息学分析预测，miR-19b-3p可通过靶向HIF-1α其3′-UTR下调HIF-1α的表达；
细胞功能研究表明，miR-19b-3p通过负调节HIF-1α、VEGF抑制A549细胞的生长、分裂、迁移和侵袭并促进凋亡。然而在一项既往肺腺癌细胞的研究中[26]，miR-19b-3p靶向GNG7在肺腺癌细胞中的表达升高，促进了肺腺癌的进展。这项研究与本研究结果不完全一致，miR-19b-3p在NSCLC中是否具有双重作用，是否存在临床组织样本及细胞异质性，其具体机制仍需要更多的基础研究进一步证实。
综上所述，本研究发现miR-19b-3p在NSCLC中表达下调，MALAT1作为ceRNA，可竞争性抑制miR-19b-3p表达，从而促进A549细胞内HIF-1α/VEGF分子轴表达。过表达miR-19b-3p可抑制A549细胞增殖、分裂、迁移、侵袭能力，促进凋亡。因病例组织标本数量相对较少，体外转染实验细胞种类单一，本研究仍存在不足。因此，对miR-19b-3p参与NSCLC疾病的具体分子机制尚需未来进一步研究。
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