徐国庆，何春华
(合肥工业大学 土木与水利工程学院，安徽 合肥 230009)
与传统生物脱氮技术相比，厌氧氨氧化工艺无需曝气和外加碳源，能够节省64%的曝气量和100%的外源电子供体，并减少了80%～90%的剩余污泥产量[1]，但是，厌氧氨氧化菌是化能自养菌，世代周期长，增殖速率慢，且对环境条件要求严苛，故其推广和应用仍将面临巨大挑战。因此，厌氧氨氧化工艺的快速启动成为广大学者研究的焦点。
颗粒污泥因具有优良的沉降性能，且其内部物种多样性丰富，微生物系统更加稳定，故加速污泥颗粒化进程能有效促进反应器中厌氧氨氧化菌的富集[2]。因此，厌氧氨氧化的颗粒化研究对于厌氧氨氧化工艺的进步意义重大。而污泥的颗粒化过程往往与金属离子有关，其中钙离子的影响重大，由于钙离子带正电，会被吸附在带负电的细胞表面，中和了电荷，使细菌表面的电荷减少形成疏水性，从而使细胞凝聚在一起。此外，在一定条件下，较高浓度的钙离子可以促进CandidatusBrocadia菌的扩增和促进双弧酸环化酶的产生，从而加速厌氧氨氧化过程[3]。因此，本实验将探究钙离子对厌氧氨氧化工艺启动过程的影响。
1.1 反应器设置与运行
如图1所示，实验由2个相同的圆柱形反应器进行，R1为对照组，R2为实验组。2个反应器均为有机玻璃材质，高150 cm，横截面直径20 cm，有效容积48 L，水力停留时间为72 h，采用电热与温控系统维持反应器内部温度为(35±2)℃，控制pH为7.6±0.2，溶解氧浓度低于2 μmol·L-1，内部循环水上升速度为1.52 m·h-1。
反应器运行过程采用SBR模式，分为进水、反应、沉淀、出水、闲置5个阶段。其中，进、出水量均为16 L·d-1，时间均控制为10 min，沉淀时间为60 min，反应时间22 h。将每天的进、出水以及各阶段体系污泥取样进行研究与分析。
图1 厌氧氨氧化反应器示意图Fig.1 Schematic diagram of the anammox reactor
1.2 接种污泥和反应器进水参数
按照活性污泥和厌氧氨氧化泥浓度比10∶1向反应器接种污泥。其中，活性污泥取自合肥市朱砖井污水处理厂的SBR生化池，接种浓度TSS为4.4 g·L-1，VSS为2 g·L-1。厌氧氨氧化污泥取自合肥工业大学土木楼106室的厌氧氨氧化反应器，接种浓度VSS为0.2 g·L-1。接种前污泥用PBS缓冲液洗脱3遍，以去除杂质和沉降性较差的污泥。
进水主要由氯化铵、亚硝酸钠、碳酸氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙以及2种微量元素组成。其中，氨氮和亚硝态氮浓度保持1∶1.32，碳酸氢钾500 mg·L-1、氯化钙180 mg·L-1、磷酸二氢钾25 mg·L-1。实验一共分为2个阶段，1～40 d 为启动阶段，进水氨氮为50 mg·L-1；
41～80 d 为提高负荷阶段，进水氨氮为100 mg·L-1。
1.3 污泥活性测定
测定污泥厌氧氨氧化活性和反硝化活性，具体操作步骤参考之前的报道[4]。
1.4 微生物群落结构分析
利用16S rRNA对各个阶段末获得的污泥样本进行微生物群落多样性分析。所有污泥样品在6 000 r/min离心5 min后去掉上清液。采用515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)引物。具体分析实验由中国上海美吉生物医药科技有限公司进行。
1.5 分析方法
TSS、VSS、氨氮、亚硝态氮、硝态氮、蛋白质含量、多糖含量等指标的测定根据标准方法[5]分别采用纳氏试剂光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法、紫外分光光度法、Lowry法和苯酚-硫酸法。
2.1 不同阶段反应器运行效果
反应器进出水污染物浓度变化如图2、图3所示，两种反应器运行1～9 d，出水氨氮均升高至60 mg·L-1，由于反应器初期污泥体系不稳定，没有碳源补给，污泥体系中大量异养或好氧微生物死亡，微生物细胞裂解会释放出氨氮，从而导致出水氨氮值的升高[6]。此后，R2在第11天出水氨氮值率先降低至45 mg·L-1，并在之后去除率大幅提高，第23天出水氨氮值达到0；
而R1在第19天出水氨氮才降低至46.5 mg·L-1，直至31 d出水氨氮值才降低至0。在第41天提高反应器进水氨氮至100 mg·L-1，由实验结果可知，R2能更快适应氮负荷的提升，其氨氮去除效果明显好于R1。
图2 反应器进出水氨氮、亚硝态氮浓度Fig.2 Concentrations of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in inlet and outlet water of the reactor
图3 反应器进出水硝态氮浓度Fig.3 Concentrations of nitrate nitrogen in inlet and outlet water of the reactor
总氮去除效果如图4所示，两反应器运行1～18 d均能实现30%左右的总氮去除率，此时反应器体系中的主导过程为反硝化作用，其后，R2的总氮去除率迅速上升，于23天达85.02%，而此时R1仅为45.81%。因此，R2内部污泥体系在钙离子作用下率先表现出厌氧氨氧化性，率先实现了厌氧氨氧化的启动，总氮去除效率率先提高，而此时R1中厌氧氨氧化过程微弱。31 d后，两个反应器的总氮去除率均能达到85%，说明此时R1也实现了厌氧氨氧化的启动。提高进水负荷后的趋势与前阶段一致，R2的总氮去除率短暂降低后在第57天回升至85%，而R1明显降低且恢复缓慢，后期最高达80%。实验表明R2具有更高的总氮去除率和更高的抗氮负荷冲击能力。钙离子能够促进部分厌氧氨氧化菌的生长，从而促进实验组污泥体系更快的实现高效脱氮效果，也与Zhen[3]所得出的结论吻合。
图4 反应器总氮去除效率Fig.4 The removal of total nitrogen in the reactor
2.2 厌氧氨氧化活性及反硝化活性变化
图5 不同阶段反应器污泥活性变化Fig.5 Variation of sludge activity in the reactor at different stages
2.3 微生物群落结构变化及分析
稳定阶段反应器污泥菌群结构分析如图6所示。研究发现，启动后R1污泥的主要菌群为unclassified_k__norank_d__Bacteria(9.51%)、PHOS-HE36(5.51%)、AKYH767(4.80%)、CandidatusBrocadia(4.40%)、JG30-KF-CM45(4.35%)、Caldilineaceae(4.25%)、SBR1031(4.09%)以及Romboutsia(2.29%)。其中，Caldilineaceae为丝状菌，其过度生长会产生更多的EPS，增加体系中的有机物浓度，引起丝状菌膨胀和起泡的问题[7]。Romboutsia是一种产酸类微生物，会对体系中厌氧氨氧化菌的生长产生一定的抑制作用[8]。R2污泥主要菌群为CandidatusBrocadia(14.37%)、SBR1031(5.21%)、Bacillus(4.56%)、AKYH767(4.12%)、Ellin6067(2.72%)、Chthonomonadales(2.51%)、unclassified_k__norank_d__Bacteria(2.03%)和Gemmatimonadaceae(2.02%)。其中，Bacillus菌属于反硝化细菌，表明R2组污泥仍存在部分反硝化作用，能有效抑制硝酸盐的积累，有利于厌氧氨氧化过程。Ellin6067菌是硝化细菌，Ellin6067能完成部分硝化的过程[9]，能与厌氧氨氧化菌共同形成短程硝化-厌氧氨氧化(PN/A)的微生物系统，促进厌氧氨氧化作用。氯化钙呈弱酸性，添加后在一定程度上能够抑制R2体系产酸细菌Romboutsia的生长，产酸菌的减少能有效维持体系pH的稳定，从而避免部分酸化而引起的丝状菌Caldilineaceae过量生长，因此R2组污泥体系能保持更加稳定的环境。此外，R2污泥体系中既有厌氧氨氧化细菌，同时具有硝化细菌和反硝化细菌，能达到类似于短程硝化-厌氧氨氧化/短程反硝化-厌氧氨氧化耦合工艺的效果[10]。
图6 稳定阶段反应器污泥在属水平上菌群结构分析Fig.6 Analysis of bacterial community structure at the genus level for the sludge at the stable stage
本研究通过在厌氧氨氧化SBR反应器中投加钙离子，发现其能明显促进反应器启动过程的脱氮效果，提高反应器内污泥的厌氧氨氧化活性，显著提高厌氧氨氧化菌的丰度。具体结论如下：
(1)钙离子的投加能将厌氧氨氧化SBR反应器的启动时间缩短8 d，厌氧氨氧化启动效率提高25.8%；
(2)钙离子能增强厌氧氨氧化反应器的脱氮稳定性，当进水氨氮浓度达100 mg·L-1时，反应器稳定阶段的脱氮效率仍能达85%以上；
(3)钙离子能有效抑制污泥体系产酸细菌的生长，减少对厌氧氨氧化过程的负面影响，促进厌氧氨氧化菌的富集，稳定阶段CandidatusBrocadia的丰度达14.37%；
(4)钙离子能促进污泥形成硝化细菌、反硝化细菌、厌氧氨氧化菌共存的状态，从而提高微生物群落结构的稳定性，提升体系的脱氮效率。
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