高 峰，程志强，于晓斌
（吉林农业大学，长春 130000）
球孢白僵菌Beauveria bassiana作为一种虫生真菌，在多种农林害虫的生物防治中都取得了明显成效，是最受关注的昆虫病原真菌之一[1]。同时其还具有对人畜无害、可生物降解且无残毒等优点[2]，使得白僵菌高孢粉成为了国家林业局推广的高效生物杀虫剂之一。当前研究人员以减少发酵成本或增加白僵菌产孢量为目的进行了广泛的研究[3-10]。孙明等[4]对白僵菌固体培养条件进行优化，得到 1011个孢子/g以上的白僵菌原粉。陈辰等[5,6]以烟草梗为发酵原料，通过相关因素的筛选得到了产孢量为8.59×109个孢子/g的白僵菌。薛皎亮等[7]通过单因素筛选，得到以黄豆粉或玉米粉为氮源，可溶性淀粉为碳源的液体培养基，在pH 5.0的条件下发酵13 d，白僵菌的产孢量最多。张亚平等[8]优化了白僵菌的液体发酵条件，使白僵菌在60 h内达到最大的菌丝生长量，为其后续固体发酵提供优质的种子液。胡加付等[9]使用麦麸为主要发酵原料，玉米粉、黄豆粉作为添加物，进行浅盘固体发酵，最终在最佳培养条件下得到了2.44亿孢子/g的白僵菌原孢粉。张亚平[10]将大米作为培养基原料，用于发酵白僵菌，在最佳条件下，得到孢子量为1.56×1010个孢子/g的白僵菌。在目前白僵菌发酵研究中发现，白僵菌对培养基的要求不高，只需给予白僵菌生长所需的营养，其就可以进行生长；
当前大多数发酵白僵菌以粮食作为发酵基质，成本相对较高。废弃菌糠是一种农业废料，指采收食用菌后的培养基剩余物[11]。数据显示，2018年我国产生的菌糠数量为1.3×108t[12]。然而在实际的生产生活中，菌糠的处理方式大都为简单的丢弃或焚烧处理，这样不仅污染环境，同时也会造成资源浪费。研究表明，菌糠中还含有丰富的菌丝体、纤维素、多糖等成分。这些剩余成分[13]仍然能为某些食用真菌生长提供所需的碳源[14]。目前农业废弃物发酵培养微生物主要有两种形式，常见的为固体发酵，也可为液体发酵，即利用含有农业废弃物（秸秆类）的液体培养基来培养微生物。研究发现液体发酵可以使底物降解过程更均匀，发酵过程更高效[15,16]。因此利用木耳菌糠培养生防真菌白僵菌有望成为降低培养成本、实现可持续发展观的有效途径之一。同时，降低白僵菌生产成本也能进一步促进白僵菌在农林害虫防治上的发展。据目前了解，尚未有关于利用木耳菌糠培养白僵菌的研究报道出现。所以本文尝试将木耳菌糠作为白僵菌的主要培养基来培养白僵菌，通过对培养基补充成分和培养条件进行单因素筛选，并进行正交试验，得到菌糠培养白僵菌的最佳条件，旨在探讨利用木耳菌糠培养白僵菌的可行性，为使用菌糠低成本发酵生防菌提供了依据。
1.1 供试材料
黑木耳菌糠来源于吉林农业大学菌物所，将菌糠粉碎并过40目筛，收集备用。
1.1.1 菌种 球孢白僵菌冻干粉（菌种编号GDMCC3.428）；
菌种活化及保藏使用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基以及马铃薯葡萄糖（PDB）培养基。
1.1.2 培养基及供试试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基和马铃薯葡萄糖培养基（上海博微生物科技有限公司）；
尿素、硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铜、硫酸镁、硫酸锰、氯化钙（均为分析纯，北京北化精细化学品有限公司）。
1.2 孢子悬浮液的制备
将活化好的白僵菌接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，恒温培养箱中25 ℃下培养7 d待孢子成熟。孢子成熟后用无菌水洗下平板中的孢子，并使用血球计数板进行计数，通过稀释得到孢子浓度为1×107个孢子/mL的孢子悬浮液，4 ℃保存备用。
1.3 菌糠培养基单因素筛选
经研究表明，废弃菌糠中所剩余的粗纤维和糖类物质，仍然可以作为某些食用菌的碳源供其生长。所以在菌糠培养基成分筛选中，本着以菌糠为主要培养基成分的原则，再根据需要添加少量氮源和白僵菌生长必需的无机盐，得到产孢量良好的白僵菌。
1.3.1 不同料液比对白僵菌产孢量的影响 试验设 8 个处理：1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8、1∶9、1∶10 和1∶12，称取2 g粉碎的木耳菌糠置于50 mL锥形瓶中，按1 g菌糠加3、4、5、6、8、9、10和12 mL蒸馏水的比例，加水混匀，进行灭菌、接种、培养及计数。在50 mL锥形瓶中按照比例加入菌糠以及补充元素后混匀，向每个瓶中放入3颗玻璃珠，瓶口使用封口膜封好，在高压蒸汽灭菌锅中，1×105Pa灭菌30 min。待培养基冷却到室温后，在洁净台中向每个锥形瓶加入100 μL的孢子悬浮液。随后在27 ℃摇床中150 r/min培养3 d，3 d后使用四层纱布对发酵液进行过滤。稀释200倍后，使用血球计数板进行计数，得出孢子数，重复3次。
1.3.2 不同无机盐对白僵菌产孢量的影响 称取2 g菌糠置于50 mL锥形瓶中，按料液比1 g∶9 mL的比例加入蒸馏水。按照试验设计，设4个处理：分别加入0.5%的硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰和氯化钙，混匀后进行灭菌、接种、培养及计数，方法同1.3.1。
1.3.3 无机盐用量对白僵菌产孢量的影响 称取2 g菌糠置于50 mL锥形瓶中，按照料液比1 g∶9 mL的比例加入蒸馏水。按照试验设计，设6个处理：加入硫酸锰量分别为0、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.8%。混匀后进行灭菌、接种、培养及计数，方法同1.3.1。
1.3.4 不同氮源对白僵菌产孢量的影响 称取2 g菌糠置于50 mL锥形瓶中，按照料液比1 g∶9 mL的比例加入蒸馏水。按照试验设计，设4个处理：加入1.0%的尿素、硝酸钠、硝酸钾和硝酸铵。混匀后进行灭菌、接种、培养及计数，方法同1.3.1。
1.3.5 氮源用量对白僵菌产孢量的影响 称取2 g菌糠置于50 mL锥形瓶中，按照料液比1 g∶9 mL的比例加入蒸馏水。按照试验设计，设5个处理：加入硝酸铵量分别为0、0.5%、0.8%、1.0%和1.2%。混匀后进行灭菌、接种、培养及计数，方法同1.3.1。
1.4 菌糠培养基成分正交试验
通过上述培养基组成的单因素试验结果，以最终产孢量为参考标准，采用正交表L9(33)设计一个3因素3水平的正交试验，料液比因素水平为1∶4、1∶5和1∶6；
硫酸锰含量因素水平为0.3%，0.4%和0.5%；
硝酸铵含量因素水平为0.5%，0.8%和1.0%。
1.5 菌糠培养基培养白僵菌的培养条件单因素试验
灭菌和计数方法与1.3.1中的方法相同，培养基参数为料液比1∶9、0.4%硫酸锰、1.0%硝酸铵。
1.5.1 不同接菌量对白僵菌产孢量的影响 分别按3%、5%、7%、10%、14%和15%接种量接入浓度为1×107个孢子/mL的孢子悬浮液。随后放置在27 ℃的摇床中150 r/min培养3 d，通过显微镜检查孢子产量。重复3次。
1.5.2 不同时间对白僵菌产孢量的影响 在无菌条件下，接入100 μL孢子悬浮液。随后放置在27 ℃的摇床中150 r/min培养3、5、7和9 d后，通过显微镜检查孢子量。重复3次。
1.5.3 不同温度对白僵菌产孢量的影响 在无菌条件下，接入100 μL孢子悬浮液。随后分别放置在25 ℃、27 ℃、29 ℃和31 ℃的摇床中150 r/min培养3 d，通过显微镜检查孢子量。重复3次。
1.6 培养条件正交试验
通过上述1.5中培养条件的单因素试验结果，以最终产孢量为参考标准，采用正交表L9(33)设计一个3因素3水平的正交试验，接菌量因素水平为5%，7%和10%；
培养时间因素水平为4 d，5 d和6 d；
温度因素水平为25 ℃，27 ℃和29 ℃。
1.7 数据统计与分析
采用SPSS 19.0对数据进行统计分析，用LSD法比较不同处理组间的差异显著性（P≤0.05），使用标记字母法标记。
2.1 菌糠培养基单因素筛选结果
2.1.1 料液比对白僵菌产孢量的影响 在菌糠加入量不变的前提下，随着加水量的增加，白僵菌的产孢量呈现先增加后减少的趋势。在料液比为1∶4时，产孢量最高，达到1.4×109个孢子/mL。其后依次是料液比 1∶5、1∶6、1∶8、1∶3、1∶10 和 1∶12。其中 1∶12 时的产孢量最低，为 1.4×108个/mL。料水比为 1∶4 和1∶5时，两组与其他处理组的差异均达到显著水平（P＜0.05），较为适合白僵菌的产孢（图1）。
图1 不同料液比（菌糠g∶水mL）培养3 d对球孢白僵菌产孢量的影响Fig.1 The effect of material-water ratio on the spore production of Beauveria bassiana
2.1.2 无机盐对白僵菌产孢量的影响 以硫酸锰为添加无机盐的培养基，白僵菌的产孢量最高，达到 5.5×108个孢子/mL，与其他处理组相比差异显著。其次依次是硫酸铜，氯化钙，硫酸镁，硫酸镁的产孢量最低，为3.3×108个孢子/mL。其中在选择的四种无机盐中，硫酸锰对白僵菌的产孢量有最显著的促进作用，因此选择硫酸锰作为菌糠培养基的添加物（图2）。
图2 无机盐对球孢白僵菌产孢量的影响（数据均为平均值±标准差）Fig.2 Effect of inorganic salt on spore production of Beauveria bassiana (Data are mean±standard deviation)
当硫酸锰浓度为0.4%时，产孢量为6.4×108个孢子/mL，与其他处理组差异显著（P＜0.05）。（图3）。
图3 硫酸锰含量对球孢白僵菌产孢量的影响Fig.3 Effect of manganese sulfate content on spore production of Beauveria bassiana
2.1.3 氮源及含量对白僵菌产孢量的影响 CK组的产孢量为4.5×108个孢子/mL，而添加氮源的处理组除了硝酸铵，其他处理组的产孢量均低于CK组，其中硝酸钠处理组的产孢量（2.9×108个孢子/mL）最低。结果表明，将尿素、硝酸钾、硝酸钠作为添加氮源，会抑制白僵菌的产孢。添加硝酸铵对白僵菌的产孢量影响不大，说明在只有菌糠的培养基中，作为氮源的硝酸铵不是限制白僵菌产孢的因素（图4）。
图4 氮源对球孢白僵菌产孢量的影响Fig.4 Effect of nitrogen source on spore production of Beauveria bassiana
就四种氮源而言，只有硝酸铵对白僵菌的产孢没有抑制效果，所以进行硝酸铵用量对白僵菌产孢量影响的测试，如图5所示，在一定浓度下，添加单一硝酸铵对产孢量增加影响不大。但是，在确定了培养基其他成分后，设置了不添加氮源的处理组（即培养基∶料液比1∶4、0.3%硫酸锰，培养条件：接菌量7%、29 ℃、4 d），最终产孢量为1.2×109个孢子/mL，对比组为添加了0.5%硝酸铵，最终产孢量为1.6×109个孢子/mL。未添加氮源的组产孢量不及添加氮源的组，说明确定菌糠培养基的料液比，无机盐添加量后，氮源的添加成为了影响白僵菌产孢量的短板，所以需要向培养基中添加氮源，并且根据2.2正交试验中关于氮源用量再次筛选中发现，硝酸铵添加量为0.5%较为合适。
图5 硝酸铵含量对球孢白僵菌产孢量的影响Fig.5 Effect of ammonium nitrate content on spore production of Beauveria bassiana
2.2 菌糠培养基成分正交试验结果
由表1可得，最佳的培养基组合为A1B1C1，即料液比为1∶4、硫酸锰含量为0.3%和硝酸铵含量为0.5%，产孢量最大，为1.9×109个孢子/mL。同时由极差R值分析可得，影响白僵菌产孢量的因素由高到低为料液比，硫酸锰含量，硝酸铵含量。
表1 菌糠培养基成分正交试验结果Table 1 Orthogonal test results of the composition of the culture medium
2.3 白僵菌培养条件单因素结果
2.3.1 接菌量对白僵菌产孢量的影响 随着接菌量的提高，产孢量逐渐增加，在天数一定的条件下，当接菌量达到7%（产孢量为6.7×108个/mL）后，继续增加接菌量，产孢量增加幅度明显变小（图6）。
图6 接菌量对球孢白僵菌产孢量的影响Fig.6 Effect of inoculation amount on the spore production of Beauveria bassiana
2.3.2 时间对白僵菌产孢量的影响 随着培养时间的增加，瓶中的白僵菌的产孢量先出现了成倍的增加，随后出现增长停滞的现象。当培养时间达第9 d时，产孢量达到最大，为1.6×109个孢子/mL。其与第3 d相比有显著差异（P＜0.05），与第5、7 d相比无显著差异（P＞0.05）。结果说明，瓶中的白僵菌数量在第5 d时已经接近饱和了，所以随着时间增长，白僵菌孢子的数量增长不大（图7）。
图7 培养时间对球孢白僵菌产孢量的影响Fig.7 Effect of culture time on spore production of Beauveria bassiana
2.3.3 温度对白僵菌产孢量的影响 温度在23～29 ℃的范围内，当温度为25 ℃时，产孢量最大，为6.7×108个孢子/mL。当温度为23 ℃时，产孢量最小，为4.6×108个孢子/mL。白僵菌在25～29 ℃的温度范围内，均适合产孢（图8）。
图8 培养温度对球孢白僵菌产孢量的影响Fig.8 Effect of culture temperature on spore production of Beauveria bassiana
2.4 培养条件正交试验结果
最佳的培养条件组合为A3B1C3，即接菌量为10%、温度为25 ℃和培养时间为4 d，产孢量最大，为2.0×109个孢子/mL。同时由极差R值分析可得，影响白僵菌产孢量的因素由高到低依次为温度，接菌量，时间（表2）。
表2 培养条件正交试验结果Table 2 Orthogonal test results of culture conditions
发酵作为生产生物农药的首要环节，其对于推广生物农药发展有着举足轻重的地位。目前研究人员发现白僵菌对营养的要求不高，可以使用相对廉价的发酵底物进行发酵。当前对于农业废弃物[17-22]发酵生防菌的研究已经有较为成功的例子。所以利用菌糠来培养生防菌是一种可行性高并且节约生产成本的方法，生防菌对菌糠进行二次利用发酵使得菌糠中的营养物质得到进一步分解，得到的产物中包含生防菌以及菌糠，生防菌可以防治某些地下害虫和病菌[23-25]，同时菌糠则可作为肥料[26-27]，促进作物生长，一举两得。
本文中菌糠为主要培养基，作为白僵菌主要碳源，并且经过试验筛选补充少量的无机盐（0.3%硫酸锰）和氮源（0.5%硝酸铵），接菌量为10%，在25 ℃下，料液比为1∶4条件下培养4 d，白僵菌的产孢量达到 2.0×109个孢子/mL，由试验结果可得，在一定的培养时间内，含水量过高，会影响发酵体系中的通气性，同时使得培养基中的养分浓度降低；
含水量过低，可能会使得培养基中的部分养分浓度高于白僵菌产孢的适宜浓度，或者使菌液和培养基混匀不充分导致所需培养时间偏长，这些都会影响白僵菌的产孢量。此外，不同无机盐对白僵菌的产孢量也会造成不同的影响。同时无机盐对于微生物生长来说，其用量少，影响大。在确定某种无机盐对白僵菌产孢呈积极影响后，再对其用量进行进一步筛选，无机盐浓度过低或过高都会抑制产孢量。由于单因素试验，只能展示出单个因素影响下各处理组的变化。但是在现实培养生产中，培养基中各个成分会相互影响，可能会与单因素条件下产生的影响不同。所以在得到单因素条件下较优的条件后，再使用这些条件进行正交试验，才能使试验更准确。在目前关于白僵菌发酵的研究中，其产孢量处于中等位置。而发酵得到的白僵菌产品，后续可以将其用于蛴螬防治，其中所含的菌糠，有望可以作为白僵菌进入土壤的缓冲基质，有增加白僵菌的存活率和防效时长的作用。
综上所述，本研究使用木耳菌糠作为主要培养基培养白僵菌，通过条件筛选和正交试验，得到了产孢量较好的白僵菌，并证实了木耳菌糠培养白僵菌的可行性，为利用木耳菌糠低成本发酵生防菌提供了依据。
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