高芳瑞，王颢潜，李瑞环，刘 娜，王 永，武玉花，李 亮，赵 新，梁晋刚*
（1.天津市农业科学院种质资源与生物技术研究所，天津 300381；
2.农业农村部科技发展中心，北京 100176；
3.中国农业科学院油料作物研究所，武汉 430062；
4.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100098）
随着生物技术产业的迅速发展，其安全性备受社会关注，对转基因生物安全监管工作，也越来越引起重视。转基因检测标准的制定是解决转基因产品检测结果不可比的根本，转基因检测标准包括标准检测方法和标准物质。标准物质是具有高度均匀性、良好稳定性和量值准确性的一种测量标准。因此，转基因生物标准的使用可以保证转基因产品检测结果的有效性和可比性[1]。转基因标准物质包括基体标准物质、基因组DNA标准物质、质粒DNA标准物质。基体标准物质由纯合的转基因植物材料和非转基因植物材料按特定的质量比例混合配置而成，是一类最早被广泛应用的标准物质。基体标准物质的优势具有与测试样品相似的物理和化学性质，减少了由基质效应引起的误差，使检测结果更可靠、稳定[2]。转基因生物 DNA标准物质是以叶片提取的DNA制备形成的标准物质。基因组DNA标准物质最大的优点是结构稳定耐储存，荧光定量PCR法使用时操作简便，缺点是需要大规模的提取和基因组DNA的质量评价，研制过程繁琐，只能用于核酸检测，不能用于蛋白质检测[3]。质粒DNA标准物质是由重组质粒DNA制备的，该重组质粒DNA包含某些转基因植物的外源基因片段和内源标准基因片段，用于检测转基因成分。比利时科学家Isabel Taverniers 最早提出质粒 DNA 标准物质的想法[4]。质粒DNA标准物质的主要优点是可以通过微生物培养进行大量繁殖并且本身不易被降解，操作过程所需的设备成本比较低廉、简单易控制[5]。单个质粒 DNA 标准物质上所具有的多靶位点可以同时检测多个转基因对象，只要确定转基因成分的目标序列（无需转基因植物原料）就能够快速便捷地构建检测转基因产品的质粒标准物质。然而随着研究的推进，质粒 DNA 标准物质检测的缺点也不断增多，如容易污染和检测误差较大（因为待测样与质粒标准物大小差异悬殊，相比基体标准物的检测结果两者并不吻合）等[6]。
转基因检测标准物质的研制关键环节尤为重要，技术要求较高。国外尤其是欧美国家自从20世纪开始，就不断地更新和完善转基因检测标准和标准物质。国际上研制转基因检测标准物质的单位较少，主要的研制单位有欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院（IRMM）和美国的 AOCS（美国油脂化学家学会）[7]。自 2008年以来，国家转基因生物新品种培育重大专项立项《转基因产品检测标准物质研制》课题，已研制了93种标准物质，获得国家级标准物质证书21项。目前，已经积累了一定的转基因产品检测标准物质研制经验。
转基因标准物质证书的申报是一直以来的疑难点，急需进一步加快申报的进度。综上可知，转基因生物标准物质的缺乏，已成为制约我国转基因生物检测技术应用与发展的主要技术瓶颈。本文将对国内外转基因植物标准物质的研究现状及不同种类的标准物质申报关键点进行阐述，以期为我国转基因标准物质进一步的研制应用提供技术支撑。
1.1 国外转基因标准物质研发概况
欧盟标准物质主要指以欧盟IRMM为核心，在欧盟资金支持下研发的标准物质，具有以BCR、ERM或 IRMM 开头的标准物质编号。欧盟研发的标准物质有基体和质粒这两种形态的标准物质。目前在售的ERM标准物质有146种，涵盖了大豆、玉米、棉花、马铃薯、甜菜等42个转化体（表1）。
表1 以转化体计不同国家/地区生产转基因生物标准物质情况Table 1 Production of gmos standard materials in different countries/regions by transformants
美国的AOCS主要研制纯品形式的标准物质，有纯阴性和纯阳性两种类型。他们认为这种策略最精确、最实用，完全可以满足监管需要。研发商生产的转基因生物标准物质在认证后可以向外出售，目前在售的标准物质有53种，涵盖了37个转化体，纯品粉末50欧元/g，纯品DNA100欧元/µg。
日本的转基因生物标准物质的管理评价体系和我国不同，其研制的标准物质不需要通过专门的管理机构进行评定和审批，研制的标准物质机构必须具备标准物质制备和生产的资质。目前，共制备了3个基体标准物质和2个质粒标准物质。
1.2 我国转基因检测标准物质研制概况
早在2006年，大连出入境检验检疫局制备了转基因大豆GTS40-3-2种子粉末两种二级有证标准物质，现已停产。随着我国转基因作物研发和监管工作的开展，特别是 2008年转基因生物新品种培育重大专项启动后，对转基因标准物质的需求更加迫切。因此，国家启动了转基因产品检测标准物质研制工作。目前，已建立了成熟的转基因产品标准物质研制技术体系，获得了国家级标准物质证书21项（表2），涵盖候选物鉴定、制备、联合定值、不确定度评估、试用性评价等关键环节，发布了一系列技术标准[8-16]。我国研制了4种类型的标准物质（表3），为转基因生物安全性评价和监测提供了有利的技术支撑。
表2 我国转基因标准物质有证一览表Table 2 List of certified gmo standard substances in China
表3 不同类型标准物质的研制过程差异Table 3 Comparison of the development process of different types of reference materials
2.1 转基因标准物质申报要求
标准物质申报的技术文件和样品的要求主要包括九个方面（表4），其中对标准物质研制机构具有严格的要求。主要体现在组织管理、文件控制等管理要求及人、机、料、法、环等技术要求。
表4 标准物质申报的技术文件和样品的要求Table 4 Technical documents and sample requirements for reference substance declaration
2.2 不同种类标准物质研制过程的关键环节
2.2.1 原材料繁殖鉴定
2.2.1.1 基体标准物质原材料繁殖鉴定 为了保证基体标准物质的质量，要求候选物应选用可繁殖的材料，如种子的重量应不少于2.5 kg；
选择同一物种同一组织器官；
典型性、转化体纯度和转化体纯合度应满足待定特性量的量值范围要求。转基因植物原材料的转化体特异性结果为阳性，其他转化体特异性检测结果为阴性，对应的非转基因原材料的转化体检测结果和其他转化体检测结果为阴性，表明原材料的典型性符合要求。选择具有资质的检测机构进行繁殖鉴定，按照NY/T673的规定抽取转基因植物基体标准物质候选物鉴定的样品，典型性鉴定取样个体数不少于3000，混合均匀，充分研磨；
转化体纯度和纯合度鉴定取样个体数不少于300，进行单粒研磨或取单株叶片研磨。按照特定的转化体特异性检测方法，对转基因植物候选物进行转化体特异性检测，记录含特定转化体个体数，计算转化体纯度，达到95%以上表明原材料符合要求。利用适用于转基因植物转化体纯合度检测的方法，公式计算如：
其中a代表含特定转化体个体数，b代表纯合体个体数。基体原材料的转基因成分含量估算值不低于待定特性量值，表明该原材料的转化体纯度和转化体纯合度符合要求。
2.2.1.2 基因组DNA标准物质原材料繁殖鉴定 对于基因组标准物质的侯选物鉴定，选用基因组DNA含量高，易于大量提取DNA的组织作为原材料，如叶片；
对采集叶片的转基因单株，逐一进行典型性鉴定和基因型鉴定，采集纯合单株的叶片作为原材料；
侯选物要完整性好，纯度高，浓度大于100 ng/µL，无PCR反应抑制物。
2.2.1.3 质粒标准物质原材料繁殖鉴定 与基体、基因组DNA、种子形态标准物质相比，质粒DNA具有不受原材料限制的特点，可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，生产制备容易，稳定性好。将检测靶标通过人工合成或PCR扩增等技术构建到质粒分子上。通过测序、酶切、扩增等方法筛选阳性质粒分子，并对阳性质粒分子进行特异性、灵敏度和可替代性测试，均符合要求的重组质粒，可作为质粒DNA标准物质的侯选物。
2.2.2 标准物质样品制备
2.2.2.1 基体标准物质样品制备 标准物质原材料经过鉴定合格之后，开始标准物质的制备过程，基体标准物质参照《农业部1782号公告-8-2012转基因植物及其产品成分检测基体标准物质制备技术规范》中的相关要求进行研制，技术路线见图1所示。关键点包括以下几项：
图1 基体标准物质候选物研制技术路线Fig.1 Technical route of preparation of matrix reference material candidate
（1）含水量测定
原材料经冷冻研磨，90%以上粉末小于180 μm，在冷冻真空干燥后，对粉末进行含水量的测定，取样量不少于3个点，要求水分含量不高于10%。
（2）配比混匀和均匀性初检
转基因基体标准物质设置不同的质量浓度，在进行质量配比时，需要将含水量和原材料纯度等因素考虑在内。要求环境温度不超过30 ℃、相对湿度不超过40%，利用固体粉末混合仪充分混合均匀。由于基体标准物质候选物不易混匀，所以在分装之前需要进行均匀性初检。基体标准物质在混匀过程中每隔 6 h取样一次，共取样4次，每次选不同的部位取样，共取样9份，每份取样100 mg。提取样品基因组DNA，采用荧光定量PCR方法测试9份样品中转化体特异性序列拷贝数与内标基因拷贝数的比值，利用F检验法考察每个时间点上9份样品的差异。样品是否混匀，以基体标准物质含量是否均匀来进行考察。均匀性初检合格后方可分装成最小包装单元。
2.2.2.2 基因组标准物质样品制备 经过典型性和基因型鉴定之后，对鉴定的纯合单株挂牌标记，当植株进入营养生长的旺盛期，采集叶片，用于基因组DNA的大量提取。基因组标准物质参照《农业部111号公告-1-2018转基因植物及其产品成分检测基因组DNA标准物质制备技术规范》中的相关要求进行研制。关键点包括以下几项：
（1）基因组DNA的提取
采用经验证的CTAB法或基因组大量提取试剂盒，提取的DNA充分溶解在0.1X TE 稀释缓冲液中。
（2）基因组质量评估
采用凝胶电泳法进行DNA分子质量的检测，要求基因组DNA主带清晰、无明显弥散、无RNA杂带；
用紫外分光光度法评价提取的基因组DNA纯度，要求OD260/OD280在1.8～2.0，OD260/OD230大于等于2.0；
用荧光染料法测定提取的DNA浓度，基因组DNA浓度值要大于100 ng/µL。将提取的基因组DNA梯度稀释，绘制检测靶标的标准曲线，计算PCR扩增效率，扩增效率在90%～110%，证明DNA溶液中没有PCR反应抑制物。
2.2.2.3 质粒DNA标准物质样品制备 质粒DNA标准物质参照《农业部公告号第323号-8-2020转基因植物及其产品成分检测质粒DNA标准物质制备技术规范》中的相关要求进行研制。关键点包括以下几项：
（1）重组质粒构建和验证
首先获得转基因植物外源基因序列和物种内标准基因序列，根据序列设计带有酶切位点的引物，利用PCR扩增，将目的片段酶切、连接、重组整合进入基础质粒载体。
（2）重组质粒DNA扩繁与DNA纯化
图2 基因组DNA标准物质制备技术路线图Fig.2 Genomic DNA standard material preparation technology roadmap
图3 质粒DNA标准物质制备技术路线图Fig.3 Technical roadmap for preparation of plasmid DNA standard materials
将重组质粒菌种接种于对应的1～5 L选择培养液，培养至对数生长期，收获菌体；
利用碱裂解法或试剂盒法提取和纯化重组DNA；
将质粒DNA用相应的限制性内切酶纯化获得线性质粒DNA；
将纯化获得的重组质粒DNA进行Sanger测序序列分析，获得完整的质粒序列；
确认和预期构建的重组质粒DNA序列的正确性。
（3）质粒DNA质量评价与浓度测定
质粒DNA质量评价与基因组DNA相同，采用紫外光吸收法。利用荧光定量PCR法评价质粒DNA质量，将纯化的质粒DNA溶液用水或TE缓冲液稀释5个浓度梯度。以梯度稀释的质粒DNA溶液为模板，进行内标准基因定量 PCR扩增，绘制标准曲线，考察检测靶标的扩增效率。利用荧光染料标记定量法PicoGreen测定重组质粒DNA的浓度。纯化的质粒浓度不低于100 ng/µL，均符合要求后，用于标准物质的分装。
2.2.3 标准物质的均匀性评估 抽取的单元分布对同一批的样品具有足够的代表性，抽取单元数取决于总体样品的单元数和对样品均匀程度的了解，抽取单元数与总体单元数[17]的对应关系见表5。
表5 抽取单元数与总体单元数的对应关系Table 5 Extract the corresponding relationship between the number of units and the total number of units
采用具有足够灵敏度的测量方法进行均匀性检验，均匀性检验应在重复性条件下（同一操作者，同一台仪器，同一测量方法，在短期内）完成。每一最小包装单元内称取不少于3份试样进行测定，测量次序应随机化，避免测量系统在不同时间的变差干扰对试样均匀性的评价。
测定抽取的每个样品中转化体特异性序列拷贝数、内标基因拷贝数的比值，对均匀性检验中的试验结果进行方差分析（F检验），计算单元内方差和单元间方差，根据二者的比值计算F值。根据自由度（v1，v2）及给定的显著性水平α（取0.05），查F分布表，得临界Fα值。比较F值和Fa的大小，若F≤Fα，单元间方差与单元内方差无显著性差异，样品均匀；
若F≥Fα，单元间方差与单元内方差有显著性差异，样品不均匀。对不均匀的样品查找原因并解决问题后进行再处理，分装成最小单元，按上述要求和方法再次进行均匀性检验。
通常将均匀性评估中使用的样品量规定为该标准物质使用时的最小取样量，基体标准物质的最小取样量为100 mg，基因组DNA标准物质和质粒标准物质的最小取样量不低于2 μL。
2.2.4 稳定性评估 稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性值随时间变化的性质，即描述标准物质特性的时间分布特征。在标准物质的研制过程中必须进行稳定性评估，稳定性检验应在均匀性检验证明样品充分均匀后进行。申报国家二级标准物质，稳定性应在6个月以上；
申报国家一级标准物质，稳定性应在 12个月以上。标准物质应在规定的保存或使用条件下，定期进行特性量值的稳定性检验，采用符合精密度要求的定量PCR方法进行测定。
2.2.5 定值 转基因植物及其产品检测基体标准物质有两个特性量值，分别为转基因粉末和粉末总量的质量分数，以及单倍体基因组中外源插入基因拷贝数与内标基因的比值。基因组DNA标准物质和质粒标准物质也有两个特性量值，分别是DNA分子或质粒分子的拷贝数浓度、外源基因拷贝数和内标基因拷贝数的比值。拷贝数比值和拷贝数浓度由多家实验室采用微滴数字PCR技术，分别获得单倍体基因组中外源插入基因与内标基因的拷贝数浓度，计算拷贝数比值。基体标准物质的质量分数通过天平称量获得，可作为标准物质的参考值。
2.2.5.1 计量学溯源性描述 转基因基体标准物质所采用的重量法是将干燥后的转基因种子粉末和非转基因种子粉末按照一定质量配比得到质量分数作为该基体标准物质的标准值，该标准值通过使用校准后的天平通过溯源链溯源到国际SI单位千克。拷贝数浓度测量值通过计量或校准后的移液器及数字PCR等仪器测量，通过溯源链溯源到自然数“1”。
2.2.5.2 定值方法的选择 基体标准物质的质量分数通过天平称量法确定，天平称量法是一种基准方法，可由一家实验室进行多次称量定值。数字PCR是一种不依赖于标准物质和标准曲线的DNA拷贝数的绝对定量技术，在标准物质制备方面，数字PCR已成功应用于白血病诊断基因组DNA标准物质（SRM2373）的定值，并得到了可靠的鉴定结果。转基因基体标准物质的定值采用数字 PCR方法进行定值。JJG 1006中要求采用多家实验室合作定值时，当采用同一种方法时，独立定值组数一般不少于8家，当采用多种方法定值测量时，一般不少于6家。对于转基因基体标准物质，采用数字PCR方法进行定值，参加定值的实验室应不少于8家。
2.2.5.3 参加数字PCR联合定值单位的要求 a）参加定值实验室配备了数字PCR设备，有熟练操作数字PCR设备的技术人员，能够对数字PCR的检测过程进行有效的质量控制；
b）对参加定值实验室组织数字PCR定值能力评估，证明实验室具备利用数字PCR进行测量的能力；
c）对定值方法进行确认，采用荧光定量PCR考察转化体特异性和内标准基因检测方法的扩增效率，保证二者的扩增效率接近；
d）考察数字PCR系统的适用性，在数字PCR平台上用确认的定量方法检测纯品DNA样品的拷贝数比值，测量结果接近理论值；
e）确定数字PCR的有效动力学范围，微流体芯片数字PCR的有效线性范围是200～700个阳性孔，对应约240～1800个拷贝的初始模版数，确定将初始模版稀释到300～1200 copies/μL，加1.8 μL到反应体系中；
微滴式数字PCR的有效线性范围是1～65000个拷贝，20 μL反应液在微滴生成器中只能生产12000～16000个有效微滴，只有微滴数大于10000时才具有统计学意义，Quality score值需低于0.85。
2.2.5.4 测量数据评估及标准值的确定 转基因基体标准物质测量数据的处理参考JJF1342-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理的要求。
（1）实验室内数据可疑值检验
获得数据后，先进行实验室内数据可疑值检验。推荐采用狄克逊法和格拉布斯法两种方法判断可疑值并剔除。
（2）实验室间数据可疑值检验
计算各实验室的测量平均值，采用狄克逊法和格拉布斯法两种方法对实验室测量平均值进行检验，判断各实验室平均值是否有可疑值。
（3）正态性分布检验
对测定数据进行正态性分布检验，采用夏皮洛-威尔克（Shapiro-Wilk）法或达戈斯提诺法（D’Agostoon）进行正态分布检验。
（4）实验室间数据等精度检验
采用科克伦法检验各家实验室实验数据平均值是否等精度，若数据等精度，则可计算所有数据的平均值，作为标准物质的标准值。
（5）标准值的确定
试验数据结果通过了以上检验后，计算总平均值和总标准差，总平均值作为基体标准物质的标准值，总标准差作为联合定值的不确定度。
2.2.6 不确定度的评定
2.2.6.1 均匀性引入的不确定度评定 由标准物质均匀性产生的标准偏差用下式进行计算：
2.2.6.2 稳定性引入的不确定度评定 采用趋势分析法进行稳定性检验时，将标准物质稳定性引入的不确定度us按照下式进行计算：us＝s（β1）·X
2.2.6.3 定值引入的不确定度评定 定值不确定度包括A类不确定度和B类不确定度。不确定度的A类评定通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按照统计学计算方法进行，标准不确定度B类评定是通过借助可利用的相关信息，进行科学的分析判断而得到的标准偏差。
2.2.6.4 合成标准不确定度 基体标准物质定值结果的总不确定度由3部分组成，分别为：标准物质定值过程中带来的A类和B类不确定度的合成不确定度uc；
标准物质不均匀性引起的标准不确定度ubb；
有效期内不稳定性引起的标准不确定度us。合成标准不确定度为：
2.3 标准物质研制报告的编写规则
研制报告的结构包含以下部分：封面、摘要、目录、概述（或引言）、标准物质样品制备、均匀性检验、稳定性检验、定值、不确定度评定、结果表达、附件。
研制报告的内容具有科学、完整、易读及数据准确的特点，报告中采用的计量单位符合国家发布的《中华人民共和国法定计量单位》的要求，并按《中华人民共和国计量单位使用方法》执行。报告中使用的术语、符号、代号应遵照国家有关标准和技术规范执行，报告中使用新的专业术语、缩略词应加以注释，报告的图、表和照片应确保能够完整清晰复制或计算机扫描。
2.4 标准物质证书和标签的要求
标准物质证书是介绍标准物质的技术文件，内容和形式应符合标准物质管理及技术要求，并确保与所研制的标准物质一同发放给用户。证书中必须包含以下几个部分：量值和不确定度、原材料来源和制备工艺、均匀性和稳定性检验、特性量值的测量方法、溯源性描述、预期用途、使用方法及安全警示等。
证书的表述遵守以下要求：a）文字表达结构严谨、用词准确、简洁清晰，不产生歧义；
b）所用术语、符号、代号等要统一，始终表达同一概念；
c）按照国家规定使用计量单位名称与符号、量的名称与符号、不确定度的名称与符号；
d）公式、图表、数据准确无误。
标签应可靠附着在每个标准物质最小包装单元上，并包含正确识别该标准物质所需的必要基本信息（如标准物质编号、名称、批次编号、研制机构等）。必要时应包含相关法律、法规所要求的健康和安全信息。
3.1 紧跟技术发展，拓宽研制领域
自2008年以来，我国启动了转基因生物新品种培育重大专项“转基因产品检测标准物质研制”，建立了成熟的研制技术体系，成功研制了一批标准物质[18]。转基因新技术的突破加速了新产品的换代升级，新型转基因技术产品的监管和质量监测是转基因技术产业健康发展的新需求和新挑战。新的基因编辑技术的突破，促进了转基因产品研发由抗虫、抗除草剂等一代产品向营养品质改善、产量提高、耐贮藏以及工业和医药等新产品的换代升级。多基因复合性状转基因技术新产品逐渐出现，已成为研发和应用重点，对新型转基因技术产品的监管和质量监测需要新的转基因检测技术和标准物质。解美霞等[19]以基因编辑水稻为研究对象，构建了野生型和编辑型质粒对照，在野生型样品中没有A碱基，而在编辑型样品中检测到该碱基。美国转基因三文鱼的商业化推动了转基因动物产品的产业化，转基因动物产品的产业化进程逐渐加快。另外利用转基因山羊、兔、鸡生产的蛋白药物已经陆续获准上市，专项中研发的转基因猪、牛、羊等也逐步成熟，走向产业化。新型生物技术产品的研发及转基因动物的产业化应用，亟待进一步拓宽标准物质的研制领域。基于定量标识需求的转基因产品检测新技术标准制定，多糖、多酚、多油脂等复杂基质中多靶标基因同时检测新技术，也亟待加强新标准物质的研制。
3.2 加强合作共赢，建立交流机制
为了加强我国转基因检测标准物质研发技术的先进性，避免重复研制，建议建立国内外合作交流机制。以信息交换、联合攻关为重点，在实现资源共享的同时，优势互补，不仅可以提高标准物质的质量，也对未来全球标准物质的发展、标准物质的申报推进意义重大。积极参与或组织国际量值比对，推动我国研制的有证标准物质走向国际，促进定值和定量结果的国际互认，畅通国内外贸易。
3.3 促进成果应用，推进产业发展
转基因检测标准物质可以应用于转基因产品检测方法研究、转基因检测实验室间研究、转基因产品定量检测数据的质量控制等。转基因产品的定量标识为转基因产品的监管和质量监督提供了量化工具，转基因检测技术和标准建立面临新需求和新的挑战。定量标识是转基因产品监管的有效手段，也是国际贸易的有效壁垒。随着数字PCR等新的基因检测技术、三代序列测定技术等新技术的出现和成熟，定量标识逐渐成为了转基因产品监管的有力工具。转基因产品的定量检测实际上经历了抽样、样品前处理、DNA提取纯化、PCR检测、数据分析等步骤，最终得到了转基因含量值，而这些步骤都会给最终转基因含量带来影响。因此急需建立标准物质信息共享推广平台，促进标准物质的推广应用，提高各检测机构的定量准确性、可靠性和可比性，实现定量检测结果的国际互认。
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