庞 瑞 蒋玙姝 张杰文
河南省人民医院（郑州大学人民医院），河南 郑州 450003
抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）脑炎是针对NMDAR 的GluN1 亚单位的抗体介导的一种罕见的自身免疫性疾病，是成人中最常见的自身免疫性脑炎（autoimmune encephalitis，AE）的类型，约占AE 患者的80%［1］。抗NMDAR 抗体通过与NMDAR交联内化、介导电流减少、阻断肾上腺素-B2受体相互作用等机制介导AE的发生［2］。在抗NMDAR脑炎发病的急性期，免疫炎症反应的快速发展可能导致严重的神经功能障碍、癫痫持续状态、昏迷和呼吸衰竭等，约70%的患者因气道保护、运动障碍、持续性自主功能障碍、意识水平波动或呼吸功能障碍而被收治到重症监护病房［3］。抗NMDAR 脑炎的重症患者比例较高，ICU治疗周期较长，对重症患者的救治是该病的重要难题［4］。
目前在抗NMDAR 脑炎临床实践中广泛使用的唯一生物标志物是识别脑脊液（CSF）中针对NMDAR 的GluN1 亚单位的IgG 抗体，这是明确诊断所必需的［5］。抗体滴度在一定程度上被认为反映病情严重程度，但该方法具有一定局限性［6］。HANSEN等［7］曾于2013年报道了1例抗NMDAR脑炎病例，患者在康复15 年后随访时，脑脊液中抗NMDAR 抗体仍为阳性，寡克隆区带提示仍有鞘内合成。这些研究提示，在抗NMDAR脑炎中抗体的持续鞘内合成并不能一定意味着脑炎处于活动期，脑脊液抗体滴度、寡克隆带与病情严重程度不一定完全匹配。因此探索重症抗NMDAR 脑炎的新的生物学标志物至关重要，尤其是为了改善目前的治疗管理，促进开发可能加速康复的新治疗方法。
细胞因子影响了B 细胞招募与分化、浆细胞的成熟与抗体分泌等体液免疫过程，T 细胞分化、细胞毒细胞功能等细胞免疫过程［8］。作为可定量测量的客观指标，细胞因子在某些疾病的诊断和治疗方面发挥着独特作用并取得较为明显的效果。重症肌无力合并胸腺瘤患者Th17 细胞数量和血清IL-17 水平升高，Th17 细胞百分比与抗乙酰胆碱受体抗体滴度存在相关性，一些研究也报道了NMO患者的血清和脑脊液IL-6 水平升高，脑脊液IL-6 水平与临床表现之间有相关性［9］。因此，通过检测细胞因子浓度可判断疾病的发展情况。多项研究表明抗NMDAR 脑炎急性期的脑脊液中IFN-γ、TNF-α、CXCL-10、CCL-22、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10和IL-17A等多种细胞因子水平升高，血浆中IL-2水平升高［10］。
细胞因子作为一类重要的免疫调节因子，在复杂的炎症反应中起着关键作用，可能成为重症抗NMDAR 脑炎病情评估的新标志物。因此我们测量了一些选定的轻、重症抗NMDAR脑炎患者血和脑脊液的细胞因子水平，包括IL-2、IL-6、IL-4、IL-8、IL-10、IL-5、IL-17、IL-1β、IFN-γ、IFN-α和TNF-α等。通过治疗前后多次检测，评估细胞因子与抗NMDAR脑炎疾病严重程度的相关性，以寻找重症抗NMDAR脑炎新的生物标志物，并为治疗提供新的方向。
1.1 受试者和样本纳入于2020-08—2022-09 在河南省人民医院就诊的51 例抗NMDAR 脑炎患者，患者在治疗前和启动一线免疫治疗2个月后分别收集血浆和脑脊液。一线免疫治疗括糖皮质激素和静脉注射免疫球蛋白（IVIG）或血浆置换。抗NMDAR患者的纳入标准为：（1）诊断符合Graus和Dalmau标准［11］；
（2）脑脊液中抗NMDAR 抗体的滴度在1：10～1：320。此外，排除标准：（1）明确或疑似中枢神经系统感染；
（2）明确或疑似视神经脊髓炎谱系疾病或多发性硬化；
（3）明确或疑似全身性免疫疾病；
（4）有恶性肿瘤病史；
（5）妊娠；
（6）入院前已在外院接受高剂量糖皮质激素冲击、静脉注射免疫球蛋白或血浆置换治疗。51例抗NMDAR脑炎患者包括17例重症抗NMDAR 脑炎和34 例非重症抗NMDAR 脑炎。参考国外需要重症监护的抗NMDAR 脑炎标准等［12］重症抗NMDAR脑炎诊断方法，达到下列条件之一者即可诊断为重症抗NMDAR 脑炎：（1）因昏迷或癫痫持续状态等在ICU治疗；
（2）严重的精神症状；
（3）伴呼吸衰竭需要呼吸机辅助治疗；
（4）严重自主神经功能障碍（中枢性低通气、心律失常等）；
（5）合并其他并发症（感染性休克、器官衰竭等）。同时招募10名提供血浆和脑脊液的患者为对照组，对照组主要诊断为正常颅压性脑积水，急性脑梗死，帕金森叠加综合征等，对照组脑脊液及血中的自身免疫性脑炎抗体均为阴性。本研究由河南省人民医院伦理委员会审查和批准，患者或其法定监护人提供了参与本研究的书面知情同意书，所有实验均按照相关的指南和规定进行。
1.2 方法
1.2.1 样本的收集和保存：收集脑脊液样本，并在1 000 g 离心10 min，然后将上清液转移到聚丙烯管中试管中。收集外周血样本至EDTA管。
1.2.2 细胞因子/趋化因子的定量检测：细胞因子，包括IL-2、IL-6、IL-4、IL-8、IL-10、IL-5、白介素IL-17、IL-1β、IFN-γ、IFN-α、肿瘤坏死因子TNF-α等，采用多重微球流动免疫荧光法检测。细胞因子检测试剂盒由青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司提供。EDTA-K2抗凝全血离心30 min，取血浆。然后将25 μg实验缓冲液、25 μg 离心血浆、25 mL 捕获微球抗体和25 μg检测抗体混合在流管中，并以500 r/min 的转速放置在摇床上。在室温下保存2 h。然后将25 μL的链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）加入到流动管中。然后避光震荡0.5 h，2 500 r/min 离心5 min，去除上清液，加入洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬（30 s），离心（1 600 r/min，5 min）去除上清液。CSF 样品未经稀释进行测量。根据流式细胞分析仪上样需求，向管中加入洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，上机检测，最后通过自动流式细胞仪获得数据。
1.2.3 临床和随访评估：采用改良的Rankin 量表（mRS）评分评估临床神经功能障碍。所有抗NMDAR脑炎患者在急性期和启动一线免疫治疗后2个月评估mRS评分。
1.3 数据分析与统计使用SPSS 26.0 进行统计学分析。用中位数和范围来描述定量数据。两两比较采用Mann-WhitneyU 检验。多组 样 本 的 比 较 采 用Kruskal-Wallis 检 验，采 用Mann-WhitneyU 检验进行事后分析。P值<0.05为差异有统计学意义。
2.1 临床资料该研究招募了21 例男性和30 例女性的抗NMDAR脑炎患者。抗NMDAR脑炎患者中位年龄为27（17～40）岁，其中58%为女性。对照组的中位年龄为36（19～51岁），其中60%为女性。患者与对照组在年龄（P=0.073）、性别（P=0.945）方面差异无统计学意义。疾病高峰时患者的临床症状包括以下一种或多种：行为异常、癫痫发作、言语功能障碍、不自主运动、昏迷、自主神经功能障碍、通气不足、局灶性神经病变和认知功能障碍。详细的临床表现及MRI、脑电图和脑脊液表现见表1。所有患者均在发病后1 个月内开始治疗，包括糖皮质激素和（或）IVIG。19 例使用环磷酰胺，11 例使用利妥昔单抗，8例使用吗替麦考酚酯，2例使用奥法妥木单抗以防止复发。急性期仅接受一线治疗（糖皮质激素和/或IVIG）、一线治疗加环磷酰胺、一线治疗加利妥昔单抗、一线加吗替麦考酚酯的患者的中位mRS分别为1（0-3）、2（0-5）、3（2-5）、2（1-3）。
2.2 抗NMDAR 脑炎患者与对照组之间的细胞因子/趋化因子水平的比较统计分析显示，与对照组相比，抗NMDAR脑炎患者血浆中IL-6（P=0.01）、IL-8（P=0.041）、IL-1 β（P=0.018）及脑脊液中IL-6（P=0.021）、IL-8（P=0.026）、IL-1β（P=0.006）水平显著上升（图1）。
图1 抗NMDAR脑炎患者与对照组之间的细胞因子/趋化因子水平比较Figure 1 Comparison of cytokine/chemokine levels between patients with anti-NMDAR encephalitis and controls
2.3 重症抗NMDAR脑炎患者与非重症抗NMDAR脑炎患者之间的细胞因子/趋化因子水平比较与非重症抗NMDAR 脑炎患者相比，重症抗NMDAR 脑炎患者血浆中IL-6（P=0.006）、IL-1β（P=0.005）和脑脊液中IL-6（P=0.033）、IL-8（P=0.008）水平显著上升（图2）。
图2 重症抗NMDAR脑炎患者与非重症抗NMDAR脑炎患者之间的细胞因子/趋化因子水平比较Figure 2 Comparison of cytokine/chemokine levels between patients with severe anti-NMDAR encephalitis and those with non-severe anti-NMDAR encephalitis
2.4 抗NMDAR 脑炎不同阶段细胞因子/趋化因子的变化102个样本被分为2组。第1组为治疗前的抗NMDAR 脑炎患者，第2 组为启动一线免疫治疗2个月后。与第1 组相比，第2 组mRS 水平逐渐下降（P=0.003）。第2 组的抗NMDAR 抗体阳性率与第1组差异无统计学意义。
统计学分析显示，1 组与2 组间血浆IL-6（P＜0.001）、IL-8（P=0.004）、IL-1β（P=0.001）和脑脊液中IL-6（P＜0.001）、IL-8（P=0.002）水平差异有统计学意义。血浆IL-1β、血浆和脑脊液中IL-6及IL-8水平从治疗前期至中期呈下降趋势，2 组间其他细胞因子/趋化因子水平无显著性差异（图3）。
图3 抗NMDAR脑炎不同阶段细胞因子/趋化因子的变化Figure 3 Changes in cytokines/chemokines at different stages of anti-NMDAR encephalitis
2.5 抗NMDAR脑炎患者mRS评分与细胞因子/趋化因子水平的相关性分析mRS 与血浆IL-6（P＜0.001，r=0.344）、IL-1β（P＜0.001，r=0.356）和脑脊液IL-8（P＜0.001，r=0.360）的水平呈正相关（图4）。
图4 抗NMDAR脑炎患者mRS评分与细胞因子/趋化因子水平的相关性分析Figure 4 Correlation analysis of mRS scores and cytokine/chemokine levels in patients with anti-NMDAR encephalitis
2.6 抗NMDAR 脑炎不同抗体滴度水平细胞因子/趋化因子的变化将治疗前后共102 份样本按脑脊液抗NMDAR抗体滴度水平分为2组。C1包括93个样品，滴度范围为阴性～1：100。C2包括9个样品，滴度范围大于1：100～1：320。统计学分析显示，与C1组相比，C2组血浆IL-1β（P=0.001）、IL-6（P=0.046）和脑脊液IL-6（P=0.014）水平显著升高。2 组间剩余的细胞因子/趋化因子的水平无显著性差异。
本研究显示，在抗NMDAR脑炎患者的脑脊液和血浆中发现了几种与B 细胞和T 细胞活化有关的细胞因子。与对照组相比，抗NMDAR 脑炎患者Th17轴相关的细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β水平升高，其中重型抗NMDAR 脑炎患者脑脊液IL-6、IL-8 和血浆IL-6、IL-1β升高更明显。先前文献中提到的IL-2、TNF-α、IFN-γ和IL-17A 水平没有显著增加，可能与所有患者都处于疾病的急性期，且抗体滴度较高有关。IL-6、IL-8 和IL-1β水平可能有助于确定疾病的严重程度。
尽管抗NMDAR 脑炎主要由体液免疫驱动，但T细胞也可能通过协调随后的炎症级联反应在抗NMDAR脑炎中发挥重要作用，并协助B细胞向记忆性B细胞和浆细胞转化［13］。细胞免疫应答根据抗原的性质和应答的阶段招募不同的T细胞亚群［14］。如Th17/Treg 比值的增加被认为是自身免疫的标志，与银屑病、炎症性肠病、类风湿性关节炎和多发性硬化症的疾病活动有关［15］。在TGF-β和IL-6的驱动下，幼稚CD4+T 细胞分化Th17 细胞，并产生IL-1β，6，7，8和17［16］。IL-1β可帮助Th1 和Th17 细胞迁移到中枢神经系统。既往文献显示IL-6是一种多效性细胞因子，可调节Th17/Treg平衡，并刺激B细胞分化和促进抗体生成，并调节中枢神经系统疾病中浆母细胞的存活［17］。IL-8是CXC谷氨酸-亮氨酸-精氨酸基序携带家族的趋化因子，通过CXCR1和CXCR2化学吸引中性粒细胞和其他髓系白细胞迁移。抗NMDAR 脑炎患者IL-6、IL-8 和IL-1β水平的升高与可能与临床状况恶化有关［18］。
图5 抗NMDAR脑炎不同抗体滴度水平细胞因子/趋化因子的变化Figure 5 Changes in cytokine/chemokine levels at different antibody titers against NMDAR encephalitis
在本研究中评估了抗NMDAR 脑炎患者免疫治疗前后细胞因子水平变化。与治疗前相比，治疗2个月后脑脊液中IL-6 和IL-8 显著降低，血浆中IL-6、IL-8和IL-1β显著降低。所有患者均接受一线免疫治疗（糖皮质激素和/或IVIG），IVIG和大剂量糖皮质激素冲击治疗可抑制多种炎性细胞因子/趋化因子的产生。以上结果表明，治疗过程中的IL-6、IL-8和IL-1β水平可用于评估患者的治疗效果和观察免疫反应的状态。随着mRS 在免疫治疗过程中逐渐降低，抗NMDAR 抗体的阳性率与治疗前相比无显著性差异，且既往研究显示抗体滴度不能完全反应疾病的状态［19］。因此，我们探讨了mRS与细胞因子/趋化因子之间的相关性，发现mRS与血浆IL-6、IL-1β和脑脊液IL-8水平呈正相关。
IL-6通过促进B细胞分化为浆细胞并产生抗体，促进Th2轴细胞因子IL-4和IL-13的产生以增强原始CD4+T细胞向Th2分化同时抑制Th1的分化，从而在适应性免疫中起到重要作用［20］。此外，IL-6 作为细胞因子合成信号在效应T 细胞（包括Th17 细胞和Th22细胞）增殖扩增过程中起到的作用，IL-6与IL-1 β、IL-21 和IL-23 等一起控制Th17 细胞编码IL-17A、IL-17F、IL-22、RORγt等相关特征基因的表达［21］。并可阻断Treg 细胞的形成和活性，因此IL-6 被认为是维持Treg 细胞和Th17 细胞功能平衡的调节因子［22］。IL-8由单核细胞、淋巴细胞、粒细胞等多种细胞产生，是大型“趋化因子超家族”的成员，人类中存在两种IL-8受体，分别为CXCR1和CXCR2受体。既往研究确定了IL-8在招募中性粒细胞到炎症部位过程中的关键作用，并提示IL-8 可能是防止中性粒细胞相关器官损伤的新靶点［23］。基于对IL-8的临床前研究，目前已开始开发人源化抗IL-8抗体和小拮抗剂，作为治疗类风湿性关节炎、银屑病等疾病的候选药物。我们的结果表明，随着抗NMDAR脑炎患者自身免疫反应加剧，临床症状随着IL-6、IL-8和IL-1β的增加而加重。这为IL-6抑制剂如妥珠单抗治疗难治性抗NMDAR脑炎的有效性提供了证据，同时提示我们IL-8 可能作为抗NMDAR 脑炎治疗的新靶点。随着临床状况的改善及mRS 评分的下降，我们观察到这些细胞因子/趋化因子的水平逐渐降低，表明免疫炎症反应逐渐减弱。此外，随着抗体滴度的升高，血浆IL-1β、IL-6 和脑脊液IL-6 水平显著升高，可能与抗NMDAR抗体的合成有关。
本研究尚存在一定的局限性，为单一中心研究，可能存在地域、人口查因。样本含量较少，可能导致一定程度的偏差。随访时间较短，不能完全反应疾病不同时期的细胞因子/趋化因子变化。只测量了部分选定的细胞因子/趋化因子，可能存在其他的潜在标记物。在未来研究中，可建立多地区、多中心的大样本研究，以期减小偏倚，寻找更准确的临床观察标记物。
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