张志良，张玉鑫，张永杰，常超
心脏可为机体血液流动提供动力，向组织器官提供充足的血流量，维持细胞正常的代谢和功能，实现机体内环境的相对恒定[1]。心脏受损后，心肌细胞大量凋亡，可造成心脏功能及其线粒体功能减弱甚至丧失，最终引发心脏疾病及线粒体相关疾病[2]。微小RNA-762（miRNA-762）是一种可在基因转录后调控细胞增殖及分化的单链非编码小RNA分子，与心肌缺血再灌注损伤有关[3,4]，但miRNA-762与心肌损伤后心脏功能及其线粒体功能的关系尚不明确。为此，本研究分析了miRNA-762对心脏受损大鼠心脏线粒体功能和心脏功能的影响，以期明确miRNA-762表达与大鼠受损心脏中线粒体功能和心脏功能的关系，为心脏疾病及线粒体相关疾病的治疗提供新的方向，现将研究结果报告如下。
1.1 实验动物SPF级的雄性的SD大鼠30只，体质量（180±20）g，购于康美华大基因技术有限公司，生产许可SYXK（粤）2019-0205。
1.2 分组、模型制备及干预处理将30只大鼠随机分为A组、B组、C组三组，每组各10只。模型制备方法：B组和C组给予戊巴比妥钠溶液（美国Sigma公司，40 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠后固定于手术台，剪短胸部被毛，碘伏（卫辉市康宝生化科技有限公司）消毒剪毛区，在大鼠胸部的正中做一切口（1.5～2 cm），开胸之后将冠状动脉左前降支结扎，0.5 h后剪断结扎线，恢复大鼠的血流灌注，造模成功的标准为大鼠结扎后的心电图ST段抬高。A组将前室间支分离但不结扎。造模成功后，C组给予50 μl miRNA-762 antagomir（广州市锐博生物科技有限公司，尾静脉注射），B组和A组给予等量生理盐水（南京乐诊生物技术有限公司，尾静脉注射）。造模失败大鼠及死亡大鼠剔除，并随机补足。各组于造模成功后的第14 d检测以下项目。
1.3 评价项目①各组大鼠心脏功能：采用GDF-V90动物多普勒超声诊断仪（郑州甘道夫电子科技有限公司）检测左室收缩末期内径（LVEDs） 、左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）、左室舒张末期内径（LVEDd）。②各组大鼠线粒体功能：将各组大鼠处死，取其心脏缺血区心肌组织，应用线粒体分离试剂盒（上海和序生物科技有限公司）分离线粒体。A：检测线粒体过氧化物生成量：向线粒体悬液内加入5 μmol/L MitoSOX（厦门研科生物技术有限公司），30 min后，用100 μl HEPES缓冲液（南京森贝伽生物科技有限公司）重悬，检测其荧光值。B：检测线粒体膜电位：向线粒体悬液内加入2 μmol/L JC-1（上海恒斐生物科技有限公司），孵育15 min后检测其荧光值，以绿色荧光值与红色荧光值之比评价线粒体损伤程度。C：检测线粒体三磷酸腺苷（ATP）生成量：向线粒体悬液内加入蛋白提取液（上海信裕生物科技有限公司），采用Mini-P25离心机（杭州奥盛仪器有限公司），10000 rpm离心10 min，取上清，使用ATP生物发光试剂盒（上海晶抗生物工程有限公司）检测ATP浓度。③各组心肌梗死面积：将各组大鼠处死，收集左心室称重，然后将其切成1～1.5 mm心肌薄片，放入2%四氮唑红磷酸盐缓冲液（上海联迈生物工程有限公司）中，37℃避光孵育10 min，于10%甲醛溶液（上海钦诚生物科技有限公司）中固定，吸干并称重，观察颜色，红色为非梗死心肌区，白色为梗死心肌区，切下梗死心肌区并称重，然后计算心肌梗死面积，心肌梗死面积=心肌梗死重量/左心室重量×100%。④各组心肌细胞凋亡率：取各组大鼠心肌组织，消化并传代后收集第3代细胞，将其制成细胞悬液，调整细胞浓度至1×106个/ml，使用1 M×Tris Buffer缓冲液（上海卉深生物科技有限公司）重悬细胞，将5 μl Annexin V-FITC（美国BioVision公司）、100 μl细胞悬液、5 μl PI染液（美国BioVision公司）加至流式管中，室温避光反应15 min，在CytoFLEX S流式细胞仪（上海实维实验仪器技术有限公司）上检测心肌细胞凋亡率。⑤各组心肌组织中miRNA-762表达量：取各组大鼠心肌组织，液氮研磨，采用总RNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取总RNA，然后将总RNA逆转录成cDNA，进行PCR扩增。引物序列：β-actin：下游GATGG TGGTCCAGGGGTCTTACT；
上游5’-TCAACGACCA CTTTGTCAAGCTCA-3’；
miRNA-762：下游 5’ -AGACAGCCAGGAGAA ATCAAACAG-3’；
上游5’-TGCACCTGACGCCCT TCAC-3’。PCR扩增体系为：反应体系共25 μl，cDNA模板5 μl，10 μmol/L上游引物各0.5 μl， 10 μmol/L下游引物0.5 μl，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液2.5 μl，dNTP 1 μl，ddH2O 15 μl。反应条件为：95℃条件下预变性3 min，95℃条件下变性20 s，72℃条件下退火延伸30 s，总共38次循环。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描获取电泳照片，然后测定各扩增条带吸光度值。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行分析，单因素方差分析中两两计量资料相比采用snk-q检验，检验水准α=0.05。
2.1 各组大鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率比较C组和B组大鼠心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率比A组增高（P＜0.05）；
C组大鼠心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率比B组降低（P＜0.05），表1。
表1 各组大鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率比较
2.2 各组大鼠线粒体功能比较C组和B组大鼠心脏线粒体过氧化物生成量比A组增高（P＜0.05）；
C组大鼠心脏线粒体过氧化物生成量比B组降低（P＜0.05）；
C组和B组大鼠心脏线粒体ATP生成量、线粒体膜电位比A组降低（P＜0.05）；
C组大鼠心脏线粒体ATP生成量、线粒体膜电位比B组增高（P＜0.05），表2。
表2 各组大鼠线粒体功能比较
2.3 各组大鼠心脏功能比较C组和B组大鼠LVEDd、LVEDs比A组增高（P＜0.05）；
C组大鼠LVEDd、LVEDs比B组降低（P＜0.05）；
C组和B组大鼠LVEF、LVFS比A组降低（P＜0.05）；
C组大鼠心脏线粒体LVEF、LVFS比B组增高（P＜0.05），表3。
表3 各组大鼠心脏功能比较
2.4 各组大鼠心肌组织中miRNA-762表达量比较C组和B组大鼠心肌组织中miRNA-762表达量比A组增高（P＜0.05）；
C组大鼠心肌组织中miRNA-762表达量比B组降低（P＜0.05），表4。
表4 各组大鼠心肌组织中miRNA-762表达量比较
心脏受损可造成心脏功能及其线粒体功能障碍，导致心肌组织坏死[5]。线粒体是真核生物体内为能量代谢提供场所的细胞器，在细胞正常生命活动中扮演重要的角色。因此，研究心脏功能及其线粒体能量代谢异常的分子机制，具有重要的临床指导意义。
miRNA-762是近年新发现的miRNA家族成员，目前主要发现其能参与胃癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤细胞的生物学行为[6]。有多项研究发现miRNA-762与心肌细胞生物学行为密切相关[7,8]，但目前相关研究主要集中在细胞实验，其在生物体内作用尚不明确。本研究通过构建心肌缺血再灌注损伤（IR）模型大鼠，发现B组（模型组）miRNA-762表达量比A组（假手术组）增高，提示miRNA-762在心脏受损大鼠中呈高表达，其可能在心肌损伤过程起到促进作用，与相关研究一致。而B组大鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率、LVEDd、LVEDs偏高，LVEF、LVFS偏低也证实了这一点。主要目前关于miRNA-762对心肌细胞损伤机制研究较多，有研究认为miRNA-762可能通过激活PI3K/Akt通路途径促进心肌细胞凋亡[9]；
还有学者发现miRNA-762可通过调控线粒体通路介导HepG2细胞凋亡[10]。线粒体功能异常目前已经证实与心肌细胞凋亡密切相关，其内在机制可能与呼吸链酶变化、NO释放、Ca超载、促凋亡蛋白表达异常等多种因素有关[11]。IR的始动环节为能量代谢障碍，电子显微镜下线粒体嵴断裂、溶解和基底膜的部分缺失，其发病机制如自由基损伤、Ca2+超载、炎症细胞的大量增多均与线粒体结构和功能异常有关[12]。本研究显示，B组大鼠心脏线粒体过氧化物生成量显著高于A组，心脏线粒体ATP生成量、线粒体膜电位显著低于A组，提示心脏受损大鼠存在明显的心脏线粒体功能障碍。有学者发现给予冠心病大鼠心肌细胞线粒体ATP敏感性K+通道开放剂二氮嗪后，给药组大鼠心肌细胞凋亡率较模型组大鼠降低，同时炎症因子及氧化应激水平也下降，提示改善心肌细胞线粒体功能能降低对心肌细胞损伤[13]。目前多项研究发现miRNAs能通过影响线粒体形态和功能、参与线粒体自噬过程对IR起作用[14]。有研究发现，miRNA-762能通过介导解耦连蛋白2（UCP2）和影响线粒体稳态，从而降低心脏保护作用[15]。本研究采用miRNA-762拮抗剂干预后，发现C组大鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率、心脏线粒体过氧化物生成量、LVEDd、LVEDs显著低于B组，C组大鼠心脏线粒体ATP生成量、线粒体膜电位、LVEF、LVFS显著高于B组，提示抑制miRNA-762表达有利于心脏受损大鼠心脏功能和心脏线粒体功能恢复，可能是治疗心脏疾病及线粒体相关疾病的新靶点。
综上所述，抑制微小RNA-762表达能够促进大鼠受损心脏中线粒体功能和心脏功能恢复，这一结论可为心脏疾病及线粒体相关疾病的治疗提供新的策略。但其具体机制尚不清楚，有待进一步研究。
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