刘仕琦，王 艳，齐 铮，李 冀＊＊
（1.黑龙江中医药大学基础医学院 哈尔滨 150040；
2.山西中医药大学中药与食品工程学院 晋中 030619；
3.山西中医药大学附属医院 太原 030024）
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）作为糖尿病患者常见的并发症，出现尿白蛋白和肾功能下降的现象，在我国成人患者发病率较高，约有五分之一的糖尿病患者受到糖尿病肾病的困扰[1]。糖尿病肾病的发病机制较复杂，较难阐明，伴随着糖脂代谢异常，氧化应激、慢性炎症反应等病理进程也参与了这一疾病的发生发展[2]。糖尿病肾病属于中医“水肿”“虚劳”“尿浊”“消渴肾病”的范畴[3]。
七味白术散（QWBZ）原方载于宋代钱乙《小儿药证直诀·下卷》，该方由人参、茯苓、白术、甘草、木香、藿香、葛根七味药组成，具有补脾益气的功效，临床采用QWBZ加减方从脾论治以健脾益气，和胃生津的方法治疗DN[4]。临床研究表明，七味白术散加味可改善早期DN患者血浆内β2-微球蛋白，胱抑素C及尿微量白蛋白的含量[5]。七味白术散联合雷米普利联合胰激肽原酶片治疗DN患者体内尿蛋白含量增高，疗效显著，安全性较高[6]。目前QWBZ加减方或辅以西药治疗DN的临床疗效显著，但作用机制并不明确。
网络药理学采用“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，系统综合地分析药物对疾病网络的干预与影响，其研究策略符合中医药学理论对疾病整体性的认识观，有利于筛选中药的有效成分及阐释中药的作用机制[7-9]。
采用网络药理学与糖尿病小鼠实验药理学相结合的方法，分析QWBZ的降糖作用，对氧化应激因子表达以及肾组织相关蛋白表达量的影响，旨在探讨七味白术散预防糖尿病肾病的潜在作用机制。
1.1 成分及疾病靶点获取
利用中药系统药理学数据库与分析平台（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）进行活性成分的筛选，以类药性（DL）、口服生物利用度（OB）为筛选参数、将获得的活性成分导入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和 SWISS TARGET PRDEICTION（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）数据库获取成分靶点构建药效物质[10-11]。
在Therapeutic Target Database（http://www.swisstarget prediction.ch/index.php）数据库和 Gene Cards（https://www.genecards.org/）数据库中输入糖尿病肾病肾病（Diabetic Nephropathy），以“score≥50”进行筛选获得疾病靶点。
1.2 网络构建及分析
String数据库（https://www.string-db.org/）构建蛋白间互作网络（PPI）。用Cytoscape可视化软件（http://www.cytoscape.org/）中merge工具做交集，再利用CytoNCA插件进行网络评估分析，选择Degree≥中位数的2倍靶点为核心靶点构建核心靶点PPI图。使用ClueGO插件对核心靶点进行富集分析[12]。
1.3 分子对接
将QWBZ中活性成分与预测关键通路中的蛋白进行分子对接，进一步验证QWBZ对DN的调控作用，PBD数据库（https://www.rcsb.org/）检索Resolution（Å）最小、结合率最高的蛋白结构，ZINC数据库（https://zinc.docking.org/）中下载化学成分的Mol2结构，AutoDock软件（https://autodock.scripps.edu/）分子对接。
2.1 材料
2.1.1 实验动物及饲料
BALB/c小鼠，8周龄，体质量（20±2）g，购自北京维通利华实验动物（SCXK（京）2016-0006），合格证11400700316274。D12492高脂饲料与普通饲料，北京蕙特比公司。
2.1.2 试药
党参（北京鹤延龄药业发展有限公司批号：170851）；
茯苓、炒白术、炙甘草、广藿香、木香、葛根（安徽盛海堂中药饮片有限公司批号：201710173、201711167、 201711160、 201711151、 201801070、201710150）均购自于同仁堂，由山西中医药大学王兵老师鉴定为正品。
丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）均购自南京建成生物工程研究所（批号分别为20200410、20200405、20200602）。链脲佐菌素（STZ，Lot：WXBC2044V，Sigma）、TGF-β1（BS-0086R，BIOSS）、ASK1（28201-1-aP，武汉三鹰）。ACTIN（GB12001）、β -actin（GB12001）、GAPDH（GB12002）、HRP标记山羊抗兔（GB23303）、HRP标记山羊抗鼠（GB23301），购于Servicebio。
2.1.3 仪器
Rt2100c酶标检测仪（Rayto），Neofuge 13R冷冻离心机（Heal Force），KZ-II匀浆仪（Servicebio），DYCZ-24DN电泳仪和DYCZ-40D转印仪（北京六一仪器），AlphaEaseFC灰度分析。
2.2 实验方法
2.2.1 动物造模与分组
BALB/c雌雄小鼠各半，8周龄SPF级，4周D12492高脂饲料，腹腔注射80 mg·kg-1·d-1STZ，3天后测定血糖浓度超过11.1 mmol·L-1，判断为是建模小鼠[13]。将建模成功的小鼠按血糖、体重，随机分为模型组、QWBZ组，模型组小鼠、QWBZ组小鼠采用高糖高脂饲料喂养，QWBZ组灌胃QWBZ煎剂18.7 g·kg-1·d-1，模型组灌胃等体积生理盐水，给药4周。空白组小鼠采用普通饲料喂养，灌胃等剂量生理盐水。
2.2.2 氧化因子含量的表达
ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中SOD、MDA、GPX的含量。
2.2.3 肾脏组织TGF-β1和ASK1蛋白表达
提取肾组织总蛋白，BCA试剂盒测定肾组织蛋白浓度。上样蛋白，室温条件下进行不同组别之间蛋白电泳，加入冰盒控制电转温度，将转好的膜于脱色摇床上用5%的脱脂牛奶封闭1 h。稀释一抗（TGF-β1 1∶1000；
ASK1 1∶1000；
ACTIN 1∶1000），4℃条件封闭过夜。TBST清洗3次，每次5 min。孵育二抗30 min，TBST清洗3次。用ECL显色液激发PVDF膜1-2 min，进行曝光，显影，拍照，去色，分析不同组别两个蛋白的目的条带和光密度值。
2.2.4 统计分析
3.1 网络药理学研究结果
3.1.1 活性成分筛选
QWBZ中活性成分的筛选条件为DL≥0.18、OB≥30%（甘草为OB≥60%），党参成分21个，茯苓成分15个，白术成分7个，甘草成分25个，葛根成分5个，藿香成分12个，木香成分8个（表1）。例如木犀草素（Luteolin）、槲 皮 素（Quercetin）、霍 香 黃 酮 醇（Pachypodol）、7-甲氧基-2-甲基异黄酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、黄豆黄素（Glycitein）等。
模型组大鼠黑色条状溃疡较多，为深层溃疡，溃疡得分为116。给予注射用雷贝拉唑钠后，大鼠的胃损伤程度有所减轻，与模型组比较，0.5、1.0、2.0、4.0 mg/kg剂量组溃疡得分均显著降低（P＜0.05、0.01）。见表3。
3.1.2 PPI网络与交集网络
构建的QWBZ成分-靶点PPI网络（图1），糖尿病肾病靶点PPI网络表示与DN有关的靶点蛋白之间的相互作用关系（图2）。
成分与疾病靶点得分前15位的成分靶点（表2），内皮生长因子受体（EGFR）和蛋白酪氨酸磷酸酶11（PTPN11）得分值高且频率高，表明靶点结合度高且与多个节点具有相互作用关系，这些靶点可能是QWBZ发挥作用的关键靶点。胰岛素样生长因子I（IGF1）、胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）和胰岛素（INS）得分值和频率均高，表示靶点结合度高，并且与多个节点具有相互作用关系，其在糖尿病肾病的发病及治疗中起着重要的作用。
将上述PPI网络做交集，设定筛选范围为degree≥16，获得33个核心靶点，PPI网络如图3所示。QWBZ联合针灸治疗糖尿病周围神经病变，可影响EGFR、IGF1等的表达水平[14]。葛根素能明显降低大鼠肝脏蛋白酪氨酸磷酸酶1B的表达，与胰岛素抵抗组相比减少了32.8%，说明葛根素的干预能够改善机体的胰岛素抵抗，可能是与降低PTP1B蛋白表达有关[15]。实验和临床依据为活性成分-靶点网络，以及治疗靶点-疾病网络关系构建提供了一定的参考。
3.1.3 通路分析
将核心靶点的基因导入DAVID数据库进行GO分析和KEGG分析，对前10条通路在微生信平台进行可视化分析（图4-5）。
GO分析发现，七味白术散与葡萄糖稳态负调控、凋亡过程正调控、磷脂酰肌醇3-激酶信号通路正调控、MAPK级联正调控、细胞迁移正调控、蛋白代谢过程、细胞对胰岛素刺激的反应正调控、细胞增殖负调控、基因表达正调控、蛋白质磷酸化的正调控等过程，QWBZ可能是通过调节多个生物过程而发挥降糖作用。
表1 QWBZ化学成分
续表
3.1.4 分子对接
图1 QWBZ成分-靶点PPI网络
图2 糖尿病肾病靶点PPI网络
图3 核心靶点PPI网络
图4 KEGG富集通路
图5 GO富集通路
图6 分子对接可视化图
将QWBZ中活性核心成分luteolin、pachypodol、quercetin、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、glycitein 与TGF-β1、AKT1、INS、ALB和EGFR蛋白进行分子对接，结合能小于-5 kcal表明成分与蛋白的结合效果好，且数值越小表明结合力越强。结果发现，5种活性成分与5个核心靶点均有良好的结合效果，均小于-5 kcal（表3）。其中luteolin结合效果最佳，与TGF-β1的结合能为-8.0 kcal·mol-1，存在氢键缔合，luteolin与EFGR结合能为-8.8 kcal·mol-1，luteolin是一种黄酮类化合物。分子对接部分可视化结果如图6所示。
3.2 七味白术散对糖尿病小鼠的作用
3.2.1 对机体氧化应激水平的影响
模型组小鼠SOD、MDA、GPX含量与空白组相比都有显著性差异（P＜0.05），其中SOD含量呈现显著降低（P＜0.05），MDA含量呈现显著升高（P＜0.01），GPX含量呈现显著降低（P＜0.05）。
QWBZ组SOD含量较模型组均呈现显著升高（P＜0.05），MDA含量较模型组降低，GPX含量较模型组有显著性差异（P＜0.01）（表4）。
3.2.2 对肾脏组织TGF-β1和ASK1蛋白表达的影响
模型组小鼠肾脏组织中TGF-β1和ASK1蛋白表达明显升高（P＜0.01）；
与模型组比较，QWBZ组小鼠肾脏组织中TGF-β1和ASK1蛋白表达明显降低（P＜0.01，P＜0.05）（图8、表5）。
表2 成分与疾病靶点得分值
表3 分子对接能量
表4 小鼠血清中氧化因子含量表达（，n=6）
表4 小鼠血清中氧化因子含量表达（，n=6）
注：与空白组比，*P＜0.05，**P＜0.01；
与模型组比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
GPX/ng·L-1 773.77±32.49 602.55±41.87**691.72±50.08▲▲组别空白组模型组QWBZ组SOD/U·mg-1 661.64±32.55 578.91±68.67*600.86±33.22▲MDA/nmol·mg-1 1.00±0.09 1.27±0.11**1.13±0.14
图8 小鼠肾脏组织中TGF-β1和ASK1蛋白表达（，n=3）
七味白术散功用为健脾益气，解决了DN患者脾气虚弱的病症。课题组前期研究表明QWBZ可以控制血糖，降低不良反应的发生[16]。网络药理学研究表明，该方中君药党参成分中α-菠甾醇、豆甾醇、菠菜甾醇具有改善细胞凋亡、血管生成、炎症等作用[17]。川芎哚及其类似物具有抗凝血、改善血液流变学，降低血液粘度的作用。黄豆黄素有抑制血管再生，抑制癌细胞，诱导细胞凋亡等作用[18]。QWBZ成分靶点中PTPN11基因属于酪氨酸磷酸酶家族，与酪氨酸磷酸酶ShP2相互作用构成磷酸化调控细胞信号传导的基础，如影响丝裂原活化从而影响炎性介质的释放发挥对糖尿病大血管病变的保护作用，进而改善糖尿病[19]。血管内皮生长因子（VEGF）可介导血管新生，并提高微血管渗透性，促进毛细血管穿透侵入组织内，可以改善糖尿病肾病中的血管性病变，改善微血管病变[20]。疾病靶点中胰岛素通过激活磷脂酰肌醇-3激酶的活性，促进蛋白激酶B磷酸化，进而增加GLUT-4转位，促进葡萄糖摄取与利用[21]。IGF-1R可通过调节PI3K/AKT调控Ras和Raf蛋白，进而激活有丝分裂原激活蛋白激酶，使得IGF-1R与其特异性抗体相结合，作用于IGF-1R进而对糖类代谢产生影响[22]。
表5 小鼠肾脏组织中TGF-β1和ASK1蛋白表达（，n=3）
表5 小鼠肾脏组织中TGF-β1和ASK1蛋白表达（，n=3）
注：与空白组比， **P＜0.01；
与模型组比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
组别空白组模型组QWBZ组ASK1 0.905±0.100 1.270±0.156**1.012±0.180▲TGF-β1 0.116±0.016 0.522±0.092**0.390±0.094▲▲
DN是糖尿病晚期肾功能衰竭、死亡的主要因素之一，表现为肾小球的病理损伤，发生机理很复杂，而氧化应激是它发生的最重要的原因之一[23]。高糖会诱导线粒体过度共作产生过量的活性氧及自由基，是糖尿病及其并发症发生的初步机理。血清SOD、MDA和GPX水平反映出机体的氧化应激状况，实验结果显示七味白术散降低糖尿病小鼠的血清MDA浓度，通过提高SOD、GPX的浓度降低了机体氧化反应水平、从而提高了机体对由于糖脂代谢紊乱而形成过量ROS的降解能力，进而减轻了糖尿病肾病的病情。
丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与了DN的发生与发展，被高血糖、前炎症因子、氧化应激等多种因素诱导激活；
经过活化后的下游信号通路，通过直接刺激下游α-受体平滑肌肌动蛋白、纤维连接蛋白以及间层纤维黏连蛋白过度氧化合成，促进急性糖尿病以及肾脏纤维化[24-25]。凋亡信号调节激酶1（ASK1）是MAPK家族的重要一员，多种应激损伤和促炎因子可激活ASK1进而MAPK通路对应激作出应答或促使细胞凋亡。ASK1在肾脏炎症，凋亡及纤维化发生的过程中起重要作用，研究表明阻断ASK1的激活，可减轻肾小球硬化和肾小球损伤[26]。转化生长因子-β1（TGF-β1）是引起肾小球细胞外基质的产生、肾小管上皮间质化、肾脏组织纤维化的重要因素，降低TGF-β1水平可改善肾小球硬化和小管间质的纤维化，延缓肾病的进程[27]。网络药理学实验结果表明七味白术散在治疗糖尿病肾病过程中涉及MAPK信号通路的调节作用；
实验药理学结果表明七味白术散对糖尿病小鼠肾脏组织中TGFβ1和ASK1蛋白表达有降低的作用，提示其对DN的防治作用与调节肾组织中TGF-β1和ASK1表达水平有关，共同揭示七味白术散对糖尿病肾病的调控作用。