张志华，杨倩，杨富民
（1. 甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；
2. 甘肃省商业科技研究所，甘肃 兰州 730010）
2021年中国藜麦种植面积约2万hm2，其中甘肃省的种植面积1 万hm2，陇藜1 号是甘肃的主栽品种［1］。多糖是构成生物体生命活动所需要的重要营养物质之一，具有抗癌、预防心脑血管疾病、缓解疲劳和抗氧化等功效。有关对藜麦多糖提取、纯化和含量测定等方面的研究主要集中在藜麦叶、秸秆及藜麦米方面［2］。如蒋玉蓉等［3］研究结果表明，藜麦叶片多糖的提取率可达到6.101 3 g/100 g，对DPPH和羟自由基的IC50（半抑制浓度）分别为31.96 μg/mL和157.62 μg/mL。郝晓华等［4］采用微波技术从藜麦秸秆中萃取多糖，提取率为1.93%，多糖对 DPPH和羟自由基的清除率为71.09%和29.72%。李佳妮等［5］采用酶解-超声联合萃取藜麦多糖，并测定其对羟自由基、 DPPH 和 ABTS+自由基的清除作用，发现多糖溶液对羟自由基清除率较高，对 DPPH 和ABTS+自由基无明显清除效果。目前对未脱壳的陇藜1号藜麦籽实多糖的提取及抗氧化研究尚未见报道，未脱壳藜麦籽实直接提取多糖，可省去砻谷工序。
本研究以陇藜1号未脱壳的籽实为试验材料，在单因素试验的基础上，采用4因素3水平响应面设计对纤维素酶提取藜麦籽实多糖的工艺参数进行优化，并对其抗氧化性进行研究，旨在为未脱壳的陇藜1号多糖提取和进一步利用奠定基础。
1.1 材料
陇藜1号购自甘肃省藜美农业科技有限公司。
1.2 试剂
纤维素酶（晟发食品科技有限公司，活力105U/g），葡萄糖、氢氧化钠、硫酸亚铁、水杨酸均为分析纯（天津光复科技发展有限公司）；
苯酚、浓硫酸、石油醚、考马斯亮蓝-G250 均为分析纯（成都市科隆化学品有限公司）。
1.3 仪器
DGG9070A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；
JA2003型电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）；
DKS26型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；
GT101 型高速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）；
RE-52 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；
STSJB-1000 型电动搅拌器（上海索廷智能设备股份有限公司）；
Lyo Quest-85 型真空冷冻干燥机（河南兄弟仪器设备有限公司）；
1510酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司）；
FTIR920 傅里叶变换红外光谱仪（天津市拓普仪器有限公司）
1.4 试验方法
1.4.1 藜麦多糖的提取 流程：藜麦粒→粉碎→过筛→脱脂→风干→加去离子水→调pH值至5→控制温度、时间、料液比、酶浓度→水浴磁力搅拌→离心→收集上清液→醇沉收集沉淀→计算藜麦多糖提取率。
1.4.2 单因素试验 参考郭怡等［6］的方法，在温度为60 ℃、时间为1.5 h，料液比为1∶35、纤维素酶用量为3%的基础条件下，保持其他因素不变，只改变其中一个因素，设置料液比分别为1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55；
温度为40、50、60、70、80 ℃；
时间为0.5、1、1.5、2、2.5 h；
酶浓度为1%、3%、5%、7%、9%。通过苯酚-硫酸法测多糖浓度，计算提取率，每组试验重复3次。
1.4.3 响应面试验 以单因素试验最佳提取条件作为自变量，以多糖的提取率作为响应值，对纤维素酶法提取藜麦多糖进行4因素3水平响应面试验，具体试验设计内容见表1。
表1 Box-Behnken试验因子及编码值Table 1 Box-Behnken test factors and coding values
1.5 标准曲线制备
参考罗春萍等［7］的方法，将200 mg 干燥葡萄糖标品溶解，100 mL容量瓶定容。吸取1、2、3、4、5 mL移入100 mL 容量瓶再次定容，取2 mL 离心管分别添加200 μL 不同浓度的标液、200 μL 6%的苯酚溶液和700 μL 浓硫酸，60 ℃水浴15 min，冷却至室温。在485 nm 下测吸光值，测定3 次，取平均值，绘制标准曲线。
1.6 多糖含量测定及提取率计算
采用苯酚-硫酸法，取200 μL 稀释的多糖待测液，蒸馏水作空白对照，在485 nm处测定吸光值，取3次平均值。
式中：C为多糖浓度；
V为样品定容后的体积（mL）；
N为稀释倍数；
M为藜麦籽实质量（mg）。
1.7 分离与纯化
将粗多糖液pH值调至5.0，加入3%的木瓜蛋白酶，60 ℃水浴酶解1 h，然后煮沸灭酶，离心，取上清液在截留量为1 000 U的透析袋中透析24 h，减压浓缩。配制Sevage 试剂（氯仿-正丁醇=4∶1），加入五倍体积多糖溶液，震荡20 min，4 000 r/min 离心5 min，取上层水相4次，加乙醇至上层水相含醇量为80%，4 ℃过夜静置，沉淀离心加蒸馏水复溶，真空冻干。
1.8 红外与紫外光谱分析
参考张彩梅等［8］方法，取2 mg 多糖粉末，与150 mg 溴化钾混合研磨均匀后压片，在波长500～4 000 cm-1的范围内进行红外光谱仪扫描。
用2 mL的蒸馏水将20 mg多糖粉末溶解，用紫外线分光光度计在220～700 nm的波长下进行检测。
1.9 抗氧化性测定
1.9.1 羟自由基清除力 参考Teng 等［9］方法，取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 多糖溶液2 mL，加入6 mmol/L 硫酸亚铁溶液2 mL，静置10 min，加入6 mmol/L 水杨酸溶液2mL，静置30 min，在510 nm测定吸光度。
式中：Ai为样液吸光值；
Aj为蒸馏水替代水杨酸吸光值；
A0为蒸馏水替代样液吸光值。
1.9.2 DPPH 自由基清除率 参考Tan等［9］方法，取4 mL 0.2 mmol/LDPPH-无水乙醇溶液与2 mL浓度为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的多糖溶液分别混合，25 ℃避光反应30 min，517 nm波长测定吸光度，计算清除率。
式中：Ax为以乙醇溶液代替DPPH 自由基测得背景对照；
Ay为再以蒸馏水代替多糖溶液测得空白对照A0。
1.9.3 ABTS+自由基清除率测定 参考Teng等［9］方法，取25 mL 7 mmol/L ABTS溶液和440 μL 140 mmol/L过硫酸钾混合，避光静置12～16 h，用无水乙醇稀释成工作液，在734 nm所测吸光度记为Ar（0.7±0.02）。取0.1 mL 梯度浓度多糖提取液（1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL），加 入ABTS+工 作 液5 mL，避光反应10 min，734 nm 所测吸光度，记为At。以无水乙醇代替ABTS+工作液所测吸光度记为A0。
1.10 数据处理
采用SPSS、Origin、Expert 8.0.6 对数据处理分析和制图。
2.1 标准曲线
标准曲线见图1。线性回归方程为：
图1 葡萄糖标准曲线Figure 1 Glucose standard curve
由R²=0.999 4，拟合度高。
2.2 单因素试验
2.2.1 时间对提取率的影响 图2所示，提取时间在0.5～2 h间，多糖提取率随提取时间的增加呈上升趋势，在2 h时多糖提取率最大（4.18%）。之后随着时间的延长，提取率开始下降。其原因可能是由于加热时间过长，少量多糖发生水解或氧化造成含量降低；
同时，由于过度热浸提，导致部分多糖包裹在固态不溶物或其他物质中沉降造成损失的缘故。这与石子林等［11］热水浸提法提取密花香薷多糖和符洪宇等［12］热水浸提法提取香椿子多糖结果一致。因此，适宜的提取时间应为2 h。
图2 提取时间对多糖提取率的影响Figure 2 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides
2.2.2 料液比对提取率的影响 图3 表明，在1∶15～1∶25的料液比范围内，随着料液比的增加，提取效果呈上升趋势，1∶25 时达到峰值（3.95%）。随着料液比的增加，提取率逐步下降。这是因为料液比增大，底物浓度被稀释，从而影响了酶解的速率和多糖的得率。因此，宜选择料液比为1∶25进行后续试验。
图3 料液比对多糖提取率的影响Figure 3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polysaccharide
2.2.3 提取温度对多糖提取率的影响 图4 可以看出，当温度在40～60 ℃，随着温度的提高藜麦多糖的提取率也逐渐增加。60 ℃时达到最大值（4.14%）。随后，温度越高，提取率则不断下降。其原因是高温影响了纤维素酶的活性。因此，适宜的提取温度应为60 ℃。
图4 提取温度对多糖提取率的影响Figure 4 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides
2.2.4 酶浓度对多糖提取率的影响 由图5可见，在1%～5%的酶浓度范围内，多糖提取率与加酶量成正比，随纤维素酶的添加量增大而逐渐升高。酶浓度在5%时达到最大，多糖提取率为4.38%。在纤维素酶添加量大于5%之后，酶促反应并没有继续加快，反而出现下降趋势，这可能是由于纤维素酶添加过多，在底物有限的条件下，影响了其作用的发挥。因此，宜选择酶浓度为5%作为后续试验。
图5 酶浓度对多糖提取率的影响Figure 5 Effect of enzyme concentration on extraction rate of polysaccharide
2.3 响应面试验
2.3.1 方差分析 试验结果见表2，回归模型方差分析见表3。
表2 试验设计及试验结果Table 2 Test design and test results
表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression models
方差分析结果表明，此模型显著（P<0.05），复相关指数为R2Adj=96.89%；
失拟项P值为0.606 5，不显著（P>0.05）。说明响应值预测性好，数值误差小。
提取时间（A）、提取温度（B）和酶浓度（D）一次项对提取率的影响为极显著（P<0.01），交互二次项AB、AC、AD对提取率的影响为显著（P<0.05）。
2.3.2 响应面优化分析 由图6～11可见，响应面图形均为山丘型，且等高线呈椭圆形，说明提取温度、提取时间、酶浓度和料液比的交互作用对提取效果有明显的影响。提取时间轴的等高线曲线光滑，提取温度轴的等高线密度较大，表明温度对藜麦籽实多糖的提取有明显的促进作用。对藜麦籽实多糖的提取效果的主要影响因子依次为：提取温度>提取时间>酶浓度>料液比。
图6 提取时间、温度对多糖提取率的响应面图和等高线图Figure 6 Response surface and contour plot of extraction time and temperature to extraction rate of polysaccharides
2.3.3 工艺条件验证 在提取温度60.54 ℃、时间2.17 h、料液比1∶20.9、酶浓度5.10%时，藜麦多糖提取率达到最高，为5.20%。为方便操作及提高重复性，调整提取时间为2.0 h、温度60 ℃、料液比1∶20、酶浓度5%，进行3 次验证试验。结果表明，藜麦多糖提取率平均为5.16%，与理论值数据接近，说明确定的工艺条件合理。
图7 提取温度、料液比对多糖提取率的响应面图和等高线图Figure 7 Response surface and contour map of extraction temperature and material-liquid ratio to extraction rate of polysaccharide
图8 提取时间、料液比对多糖提取率的响应面图和等高线图Figure 8 Response surface map and contour map of extraction time and material-liquid ratio to extraction rate of polysaccharide
图10 提取温度、酶浓度对多糖提取率的响应面图和等高线图Figure 10 Response surface and contour map of extraction temperature and enzyme concentration to polysaccharide extraction rate
图11 料液比、酶浓度对多糖提取率的响应面图和等高线图Figure 11 Response surface map and contour map of material-liquid ratio and enzyme concentration to polysaccharide extraction rate
2.4 红外与紫外光谱分析
与多糖的特征峰相比，3 420.62 cm-1处为一宽的多糖分子间或分子内O-H伸缩振动引起的吸收峰，2 930.79 cm-1处为非对称结构的C-H伸缩振动引起的吸收峰［13］，表明该提取物为多糖类物质。1 654.14 cm-1处存在一个C=O 伸缩振动吸收峰，1 402.47～1 085.24 cm-1处有C-H 变角振动吸收峰，1 026.40 cm-1处的吸收峰是由吡喃糖环的醚键C-OC 所产生，618 cm-1处有吸收峰说明具有β-型糖苷键，证明提取物符合多糖结构特征和官能团特性［14］。
220～700 nm 藜麦去蛋白粗多糖紫外光谱如图13 所示。由图13 可知，提取的粗多糖不含蛋白质、核酸，这与江琦［15］等研究表明的200～220 nm为多糖特征峰，260、280 nm 处为核酸蛋白特征峰的结果一致。
图12 藜麦多糖红外图谱Figure 12 Infrared spectra of quinoa polysaccharide
图13 藜麦多糖紫外图谱Figure 13 UV spectrum of quinoa polysaccharide
2.5 抗氧化性测定
2.5.1 羟自由基和DPPH 自由基清除率 图14可见，在浓度为1～5 mg/mL 的范围内，随着多糖浓度的增大，羟自由基清除率逐渐提高。在浓度为5 mg/mL时清除率可达60.55%。
图14 羟自由基清除效果随藜麦多糖浓度的变化情况Figure 14 Changes of scavenging effect of hydroxyl radical with concentration of Quinoa polysaccharide
图15 表明，随着溶液浓度的增大，藜麦粗多糖对 DPPH 自由基的清除速度逐渐提高，3.0 mg/mL时DPPH 自由基的清除效率达到44.04%，但低于VC。
图15 DPPH自由基清除效果随藜麦多糖浓度的变化情况Figure 15 DPPH free radical scavenging activity in relation to the concentration of Quinoa polysaccharide
2.5.2 ABTS+自由基清除率 图16 所示结果表明，随着浓度的增大，藜麦粗多糖对 ABTS+自由基的清除作用逐渐增强，当浓度为3 mg/mL时，其清除率为9.09%。与 DPPH 自由基清除率比较，去除效率相对较低。
图16 ABTS+自由基清除效果随藜麦多糖浓度的变化情况Figure 16 ABTS+ radical scavenging effect changes with the concentration of quinoa polysaccharide
只有在最佳pH值、提取温度、提取时间、料液比和酶浓度下，酶才能最大限度地发挥其作用。藜麦籽实由外部颖壳和内部藜谷组成，富含纤维素。纤维素酶促进植物细胞壁溶解的同时，还可促使纤维素和半纤维素分解成寡糖和单糖，加快胞内物质溶出速度［16］。由于底物结构的复杂性，纤维素酶能够特异性地吸附在底物纤维素上，并与不同成分协同作用，使其降解为葡萄糖。
本试验采用未脱壳的藜麦籽实，在提取时间为2.0 h、温度为60 ℃、料液比1∶20、酶浓度5%的条件下，其多糖提取率最高，为5.16%。这与郭怡等［6］报道的在料液比1∶32、酶用量2 000 U/g、温度65 ℃、时间90 min 最优条件基本一致。从提取率来看，本研究低于郭怡等［6］报道的提取率8.0%，但高于徐澜等［17］报道的采用超声波辅助法提取藜麦种子多糖的结果（偏关县2 094.5 μg/g，静乐县1 781.5 μg/g）。分析其原因是因为郭怡等使用的是藜麦米，徐澜等采用的是超声波辅助水提法。由此可见，对于未脱壳的藜麦籽实体，采用纤维素酶提取多糖，可显著增加多糖得率。
傅里叶红外光谱测定表明，本研究获得的藜麦多糖具有糖类化合物红外特征峰。紫外光谱显示，纯化后的藜麦多糖不含核酸和蛋白质。多糖类化合物是由糖苷键结合、聚合程度不同的物质所混合的高分子碳水化合物，具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤和降血糖等生物活性［1］。从抗氧化性来看，陇藜1号藜麦籽实多糖对羟自由基和DPPH 自由基清除效果显著，对ABTS+自由基清除作用一般。藜麦多糖含量丰富，具有无毒、无害、无残留、无抗药性等特点，未来开发利用前景广阔。
纤维素酶可促使纤维素和半纤维素分解，提高多糖提取率。影响未脱壳藜麦籽实多糖提取率的主要因素依次为提取温度>提取时间>酶浓度>料液比，在提取时间为2.0 h、温度为60 ℃、料液比1∶20、纤维素酶浓度5%的条件下，其多糖提取率可达到5.16%左右。抗氧化性是评价多糖的重要指标之一，陇藜1号藜麦籽实多糖对羟自由基、DPPH 自由基清除率效果好，对ABTS+自由基清除率相对较低。
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