唐小懿，梁迪，陈思敏
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)属于革兰氏阴性菌，是一种常见的获得性条件致病菌，广泛存在于自然界中，可作为正常菌群或致病菌存在于人类皮肤、胃肠道以及呼吸道；
是最常见的院内感染和呼吸机相关性肺炎细菌[1]，占院内感染死亡率的10%-20%[2]。铜绿假单胞菌因极易产生生物被膜而降低抗生素的治疗效果[3,4]。近年来，伴随抗生素的过度使用，铜绿假单胞菌耐药性或多药耐药性的层出不穷，通过遗传或获得性耐药机制对多种抗生素产生耐药性，如喹诺酮类、β‐内酰胺类和氨基糖苷类[5]。由此导致临床经验性用药变得困难和难以执行。
中药因其多成分，多靶点特性，可对抗菌效应的多个环节发挥作用，甚至延缓和逆转细菌耐药性的产生。研究表明，众多中药有效成分能通过抑制群体感应(QS)[6-9]、生物膜[10,11]以及直接杀菌作用[12,13]等途径有效控制铜绿假单胞菌感染；
以及促进抗生素穿透生物膜，提高细菌对抗生素的敏感性[14]，增强抗生素对铜绿假单胞菌的抗菌作用[15-17]。安息香为芳香开窍药，具有开窍醒神，活血行气之功效。研究发现安息香提取物具有抗菌活性[18]；
在研究中发现，安息香提取物具有通过抑制P-糖蛋白(P-gp)转运酶活性来提高药物穿透血脑屏障，以及降低细胞膜通透性来促进药物内流的特性[19,20]。
本研究通过对医院临床分离的铜绿假单胞菌进行多药耐药株筛选和最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)测定，选取多药耐药性菌株进行XCQ的抗菌增效研究，包括体外敏感性实验和体内保护性实验。采用牛津管法考察不同剂量的XCQ溶液对抗生素抗菌增效现象，以及结合感染小鼠的体内保护性试验进一步验证此作用。为临床抗生素联合XCQ对抗铜绿假单胞菌的应用提供参考依据。
1.1 试验药物与试剂
XCQ，含量>98.0%.，批号4UPIK-AU，购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；
左氧氟沙星，含量>98.0%，批号F2110154，硫酸庆大霉素，批号E2128310，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
抗生素纸片(左氧氟沙星(5 μg/片，LVF)、头孢曲松(30 μg/片，CRO)、头孢噻肟(30 μg//片，CTX)、头孢他啶(30 μg/片，CAZ)和氨曲南(30 μg/片，AZT))，均购买于比克曼生物科技有限公司；
0.9%氯化钠注射液，批号H51021158，购自四川科伦药业股份有限公司。
1.2 试验菌株及动物
铜绿假单胞菌临床株，由攀枝花市中心医院提供。KM小鼠51只，8周龄，体重18-22 g，雌性，购买于成都达硕实验动物有限公司。
1.3 培养基
MHA、MHB培养基(均购自OXOID公司)，MHA琼脂培养基38 g于1000 mL纯水中，加热溶解；
MHB液体培养基21 g于1000 mL纯水中，加热溶解。高压灭菌锅121℃，15 min进行消毒杀菌，4℃冰箱保存备用。
1.4 实验药液的配制
电子分析天平准确称取适量的XCQ、左氧氟沙星和庆大霉素粉末，用无菌纯水分别配置成高浓度的母液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，封口胶封口，保存于‐20℃冰箱，备用。实验前稀释成所需溶液浓度。
1.5 试验菌液制备
将保存在‐20℃冰箱的铜绿假单胞菌临床株纸片在MHA培养基上复活，挑选长势良好的单一菌落重新接种于新的MHA平板，生长过夜。挑取一定量的过夜细菌，用无菌生理盐水重悬，得0.5麦氏浓度菌液（1.5 ×108CFU﹒mL-1）；
再用生理盐水稀释10倍，即我们实验所需菌液浓度。
1.6 体外敏感性实验
1.6.1 铜绿假单胞菌临床株多药耐药菌的筛选 采用5种含药抗生素纸片（左氧氟沙星（5 μg）、头孢曲松（30 μg）、头孢噻肟（30 μg）、头孢他啶（30 μg）和氨曲南（30 μg））对9株铜绿假单胞菌临床株进行体外敏感性检测。将9种铜绿假单胞菌临床株菌液均匀涂布于MHA平板上，并放置不同含药抗生素纸片，用镊子轻轻按压纸片，使其紧密贴合培养基，倒置于37℃培养箱，过夜培养（18-24 h），用直尺测量抑菌圈直径大小，以抑菌圈最长边作为我们的测量直径。药物敏感度判定参考NCCLS。
1.6.2 MIC值测量 采用琼脂对倍稀释法[21]，将硫酸庆大霉素、左氧氟沙星、XCQ用无菌纯水配置成15个不同浓度的药液，分别取1 mL于90 mm无菌培养皿中，加入14 mL MHA培养基，混匀，使得最终浓度分别为：硫酸庆大霉素/左氧氟沙星/XCQ(128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.0.6，0.03，0.015，0.008 μg.mL-1)。
将临床株均配置成0.5麦氏浓度的菌液，稀释10倍后，各吸取1 mL于石英小试管，并放置于多点接种仪中，在不同含药培养基平板表面进行接种；
为了检验测试菌的生长活性和在接种过程中是否被污染，在接种前和接种后分别点种一个不含抗生素的空白MHA培养基。待菌液吸收干燥后，将培养板倒置，37度培养过夜(18-24 h)后观察是否有菌斑产生。以无菌斑生长的最低药物浓度作为最小抑菌浓度(MIC)。
1.6 XCQ联合庆大霉素的体外抗菌活性 按照1.5操作步骤，将所配菌液均匀涂布于MHA平板后，放置5个相同规格的已灭菌牛津管，其中一管只加200 μL庆大霉素溶液，另三管加入100 μL庆大霉素溶液和100 μL ⅩCQ药液；
根据文献[19]，我们采用XCQ最高浓度为100 μM，再按照对倍稀释方式，共获取3个浓度梯度溶液，依次为100 μM、50 μM和25 μM；
最后一管加入200 μL的100 μM ⅩCQ药液。庆大霉素我们采用NCCLS药敏实验的推荐剂量10 μg。使得最终剂量分别为庆大霉素：10 μg， XCQ：1.5215、0.76和0.38 μg。于37℃培养箱培养18-24 h,观察结果并测量抑菌圈直径。
1.7 XCQ联合庆大霉素的体内保护试验
1.7.1 MLD100感染浓度测定 将铜绿2019-32菌株配制成不同浓度菌液，分别为0.5、1、2、3、4麦氏浓度，菌浓度分别为1.5×108、3×108、6×108、9×108、12×108CFU﹒mL-1。每个菌浓度为一组，共5组，每组3只动物。分别尾静脉注射0.2 mL菌液，观察5 d（120 h）内各组小鼠的存活情况，并计算菌株对感染小鼠的MLD100。
1.7.2 药物对感染小鼠的体内保护性 将实验动物按照体重均匀随机分为3组（每组12只）：模型组（M）、庆大霉素组（GM）和庆大霉素联合XCQ（GM+XCQ）组。通过小鼠尾静脉注射MLD100 0.2 mL进行感染，在注射前3 h GM+XCQ组通过灌胃方式给与每只小鼠XCQ 140 mg﹒kg-1，菌液注射完成后立马灌胃给与GM溶液31.2 mg﹒kg-1，GM组在造模后灌胃给与GM溶液31.2 mg﹒kg-1，M组在造模后灌胃给与纯水。定时观察5 d（120 h）内感染小鼠的生存率。利用GraphPad 8.0.1软件绘制生存曲线。
2.1 多药耐药菌筛选结果
由表1，选择了喹诺酮类抗生素、β‐内酰胺类抗生素和头孢菌类抗生素进行铜绿假单胞菌临床株的多药耐药菌筛选。其中同一种药物对不同临床株表现出不同的抑菌活性。可以看出，对于左氧氟沙星(LVF)而言，除了铜绿2019-32之外，所有菌株都表现为敏感性；
对于头孢菌素类抗生素，无敏感性菌株，耐药率达100%。对于氨曲南(AZT)，除铜绿2019-13和2019-32两株菌表现为耐药外，其余都表现为敏感性。综合实验结果，只有铜绿2019-32菌株满足该试验多药耐药菌的评选标准。
表1 5种抗菌药物对9种铜绿假单胞菌临床株的体外敏感性(抑菌圈直径/mm)
2.2 抗菌药物对9种铜绿假单胞菌临床株的MIC
试验抗菌药物对9种铜绿临床株的MIC见表2，由表可见，左氧氟沙星(LVF)对9株菌的MIC最低，在0.03‐0.125 μg﹒mL-1之间，有较好的抑菌效果；
庆大霉素（GM）对9株菌的MIC均≥1 μg﹒mL-1，且对2019-13的MIC超过了128 μg﹒mL-1，对2019-32的MIC为1 μg﹒mL-1，由该试验设计的XCQ最高浓度均未表现出抑菌活性。
表2 最小抑菌浓度（MIC）测量结果（μg﹒mL-1）
2.3 XCQ联合庆大霉素的体外抗菌活性
根据前期实验，铜绿2019-32对三类抗生素都表现出耐药现象，且对庆大霉素的MIC最低，因此，我们选用该菌株进行后续的敏感性实验。采用牛津管法来探讨庆大霉素联合XCQ的体外抗菌活性。由表3可知，GM对于所有试验临床株来说抑菌圈直径大小存在明显差异，范围由12-23 mm，表现为敏感性不同。当与XCQ联合应用后，对大多数菌株来说抑菌圈直径明显增大，增效作用可高达77.78%；
且对铜绿2019-1、铜绿2019-13和铜绿2019-32三种菌株的抑菌作用存在明显的量效关系（见表4）。表明XCQ在体外能加强庆大霉素的抗菌作用。
表3 XCQ联合庆大霉素对铜绿假单胞菌临床株的抑菌圈直径/mm
表4 XCQ联合庆大霉素后对铜绿假单胞菌临床株的抗菌增效百分比（%）
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2.4 XCQ联合抗菌药物对感染小鼠的体内保护作用
2.4.1 MLD100试验结果 5个预试菌液浓度中，在观察时间内9×108和12×108CFU﹒mL-1两个浓度满足感染要求，因此我们选择较低的菌液浓度作为我们的MLD100，即9×108CFU﹒mL-1。
表5 MLD100预试试验结果（n=3）
2.4.2 XCQ对感染小鼠的体内保护作用 为了进一步了解XCQ在体内是否也具有同样的协同增效作用，我们选用氨基糖苷类抗生素庆大霉素联合XCQ来进行探讨。通过小鼠最小致死量MLD尾静脉注射方式进行造模，在进行不同的药物干预后，观察5 d内小鼠的生存率，并绘制生存曲线。由图1可知，在观察时间内，模型小鼠死亡率达100%；
与模型组相比，庆大霉素对感染小鼠的保护作用提高了16.7%，而联用XCQ后，保护作用提高到41.7%。说明XCQ在体内也能提高抗菌药物的治疗作用。
药敏实验检测中，针对试验的5种抗菌药物，铜绿2019-32的耐药率达到100%；
通过MIC值测定显示，铜绿2019-32对庆大霉素的敏感性最高，MIC值为1 μg﹒mL-1，根据NCCLS判断标准，判定为敏感，即具有较好的抗菌效应。目前，从临床感染患者中分离出来的多药耐药性铜绿假单胞菌越来越多，这也是治疗失败的主要原因[22]。庆大霉素属于氨基糖苷类药物，氨基糖苷类抗生素也是国内外临床常用药之一，且对对多种革兰氏阴性菌具有较强的抗菌活性。庆大霉素作用方式与细菌核糖体30S亚基结合从而抑制细胞内蛋白质合成有关[23,24]，但随着长期使用，耐药性问题也相继出现。研究发现，16S rRNA甲基转移酶通过特异性甲基化A1408，造成该类抗生素与细菌核糖体的结合能力大幅度降低，从而引发致病菌对该类抗生素的高度耐药性[25,26]。
在体外敏感性实验中，我们发现，对不同试验菌株来说，仅用庆大霉素可产生大小不一的抑菌圈直径，表现为耐药到敏感，这可能与分离株的基因型不同有关。当联合XCQ作用后，对大部分菌株来说都有明显的增效现象。有研究已表明，XCQ具有促进细胞膜流动性，增加膜通透性和促进药物内流的特性[19]。因此，我们猜测XCQ对抗菌药物的协同增效作用可能与增加细胞壁渗透性有关，从而促进抗菌药物的内流。
本文选取多药耐药菌2019-32进行XCQ联合抗菌药物的体内协同增效研究。建立小鼠血液铜绿假单胞菌感染模型，通过给与庆大霉素或庆大霉素和XCQ溶液考察药物对感染小鼠的治疗作用。本次实验中庆大霉素31.2 mg﹒kg-1剂量相当于临床人体用药240 mg。实验结果表明，随着药物干预时间的延长，治疗组动物存活数高于模型组；
且联用XCQ后对小鼠的保护作用进一步提高。这与体外实验结果一致。因此我们认为芳香开窍药安息香提取物XCQ在体内、外均能促进庆大霉素对铜绿假单胞菌的抗菌作用。