吕霞，黄丽，张美琳，樊珺婷，马泽微，刘欢
抑郁症是一种以情绪低落、兴趣减退和快感丧失为主要症状的精神类疾病，目前全球抑郁症的患病率约为4.3%［1］，中国人的终生患病率约为3.3%［2］，已成为非正常死亡和致残的主要原因之一。抑郁症发病机制复杂，近年来研究表明神经炎症与抑郁症密切相关［3］，其中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体是固有免疫的重要组成因子，介导多种动物模型外周和中枢炎症反应及抑郁样行为表现［4-5］。Toll样受体4（TLR4）与炎症体信号通路存在复杂的关联［6］，而核因子κB（NF-κB）传递信号对NLRP3的激活是必需的［7］。氟西汀（fluoxetine）是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs），主要通过抑制中枢神经系统突触前释放的5-羟色胺再摄取，增加脑内5-羟色胺供给，从而有效控制抑郁症状。研究发现，氟西汀在神经系统疾病中具有抗炎潜力，可抑制促炎因子的水平［8］。但氟西汀能否通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3炎症体信号通路而改善抑郁大鼠的抑郁样行为尚鲜见相关报道。本研究采用慢性不可预知性轻度应激（CUMS）构建大鼠抑郁症模型，在明确氟西汀改善CUMS大鼠抑郁样行为的基础上，进一步探究其对TLR4/NF-κB/NLRP3炎症体信号通路的影响。
1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠18只，6~7周龄，平均体质量（180±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司［动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010］。于北京灵赋生物科技有限公司实验动物中心SPF级环境内饲养，温度（22±2）℃，相对湿度60%±5%，光照/黑暗12 h交替。
1.2 实验试剂及主要仪器 氟西汀购自上海吉至生化科技有限公司；
白细胞介素（IL）-1β和IL-18酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；
BCA蛋白定量试剂盒和山羊抗兔二抗购于山东思科捷生物技术有限公司；
山羊抗兔NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、TLR4、NF-κB、胱 天 蛋 白 酶1（Caspase-1）和 活 化 的Caspase-1（cleaved Caspase-1）抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；
山羊抗兔荧光二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。ChemiDocTM XRS成像系统、多功能酶标仪和电泳仪均购自美国Bio-Rad公司；
倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司。
1.3 研究方法
1.3.1 动物分组、给药及CUMS模型的建立 适应性喂养1周后，将大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组和氟西汀组，每组6只。模型组和氟西汀组参照文献［9］进行CUMS造模。刺激方式包括：禁食12 h，禁水12 h，昼夜颠倒，垫料潮湿8 h，60 Hz噪声刺激1 h，夹尾2 min，摇晃鼠笼15 min，4℃冰水游泳5~10 min，束缚2 h。每天从9种刺激方式中随机选择2种，3 d内不重复，持续刺激11周。CUMS干预第7周开始，氟西汀组灌胃氟西汀（10 mg·kg-1·d-1），其余组灌胃1 mL生理盐水，连续给药5周。给药5周后，进行行为学检测。行为学检测结束后所有大鼠禁食过夜，采用吸入CO2安乐死处理，断头后取出完整脑组织，右侧脑组织经液氮快速冷冻后保存于-80℃冰箱备用，左侧脑组织于4%多聚甲醛固定并进行石蜡包埋。
1.3.2 旷场实验观察大鼠抑郁样行为 在第11周CUMS干预结束后进行旷场实验，将每只大鼠单独放置在旷场实验箱（100 cm×100 cm×40 cm）的底部中心区域，实验箱底部分成16个相等的正方形。经过30 s的适应后，使用自动视频跟踪系统记录5 min内动物的水平运动距离及垂直站立次数。每次实验后，用乙醇清洁设备。
1.3.3 高架十字迷宫实验观察大鼠抑郁样行为 高架十字迷宫实验设备是由2个开臂（50 cm×10 cm）、2个闭臂（50 cm×10 cm×40 cm）和1个中心平台（10 cm×10 cm）组成一个十字形结构。在每次测试前，将大鼠单独放在中心平台上，面向同一个闭臂，并允许其自由探索迷宫5 min。采用自动视频跟踪系统记录其水平运动距离及停留在闭臂的时间。每次实验后，用乙醇清洁设备。
1.3.4 ELISA检测脑组织IL-1β和IL-18的含量 取适量脑组织，按质量体积比1︰9加入PBS，使用手持匀浆仪于冰上研磨后，低温14 000 r/min离心15 min，取上清液。先使用BCA试剂盒定量上清液中的总蛋白，然后严格按照ELISA试剂盒说明书进行标准品的稀释，加样，并依次完成温育、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止反应等过程后，使用酶标仪在450 nm波长处依序测量各组大鼠脑组织中炎性因子IL-1β和IL-18的光密度（OD）值，最终根据稀释倍数及BCA蛋白定量计算脑组织中炎性因子IL-1β和IL-18的含量。
1.3.5 免疫荧光染色观察海马CA3区及皮质区NLRP3、ASC和Caspase-1的表达 石蜡包埋的左侧脑组织切片（4μm），于60℃恒温箱烤片15 min后进行免疫荧光染色。依次进行脱蜡、水化、封闭、抗原修复、封闭、抗体孵育等过程，使用抗荧光淬灭剂封片，并用倒置荧光显微镜拍照保存。
1.3.6 Western blot检测各组大鼠脑组织TLR4/NF-κB/NLRP3炎症体信号通路相关蛋白的表达 右侧脑组织于冰上解冻后加入适量组织裂解液，充分研磨后离心取上清液为蛋白质样品，BCA法计算蛋白质浓度。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，各组等蛋白质量上样、电泳和转膜，3%脱脂牛奶封闭1 h后，加入一抗稀释液（1︰10 000），4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，加入二抗稀释液，于室温孵育1 h，TBST洗涤3次。显影剂显色，凝胶成像系统进行蛋白条带的曝光和成像。
1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0进行数据分析，采用均数±标准差（）表示。组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 氟西汀对CUMS大鼠行为学的影响 与对照组相比，模型组大鼠在旷场的运动距离及站立次数均显著减少（P＜0.05），在高架十字迷宫的运动距离减少，且在闭臂的停留时间增加（P＜0.05）；
与模型组相比，氟西汀组大鼠在旷场的运动距离及站立次数均明显增多（P＜0.05），在高架十字迷宫中的运动距离增加，且在闭臂的停留时间减少（P＜0.05），见表1。
Tab.1 Depression-like behavior changes of rats in each group表1 各组大鼠抑郁样行为变化（n=6，）
Tab.1 Depression-like behavior changes of rats in each group表1 各组大鼠抑郁样行为变化（n=6，）
＊＊P＜0.01；
a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05。
组别对照组模型组氟西汀组F旷场实验总运动距离（m）12.14±3.89 3.75±2.25a 10.66±2.12b 14.555＊＊站立次数10.67±4.84 3.17±3.12a 10.67±3.39b 7.550＊＊高架十字迷宫实验总运动距离（m）8.24±1.79 2.21±1.18a 7.96±1.62b 28.763＊＊闭臂停留时间（s）237.98±7.32 284.32±7.99a 208.38±27.41b 30.342＊＊
2.2 氟西汀对CUMS大鼠脑组织IL-1β和IL-18含量的影响 与对照组相比，模型组大鼠脑组织IL-1β和IL-18的含量显著增加（P＜0.05）；
与模型组比较，氟西汀组大鼠脑组织IL-1β和IL-18的含量显著降低（P＜0.05），见图1。
Fig.1 Comparison of IL-1βand IL-18 in brain tissue of CUMS rats between the three groups图1 各组CUMS大鼠脑组织IL-1β和IL-18含量比较
2.3 氟西汀对CUMS大鼠脑组织NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响 免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，模型组大鼠海马CA3区和皮质区NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表达显著升高（P＜0.05）；
与模型组相比，氟西汀组NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表达明显降低（P＜0.05），见图2、3。
2.4 氟西汀对CUMS大鼠TLR4/NF-κB/NLRP3炎症体信号通路的影响 与对照组比较，模型组大鼠TLR4、NF-κB、NLRP3、cleaved Caspase-1和Caspase-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；
与模型组比较，氟西汀组大鼠上述蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），见图4、表2。
3.1 氟西汀可以改善CUMS大鼠的抑郁样行为 CUMS刺激符合抑郁症诱发因素（长期、慢性、低强度的压力刺激）的特征，能够高效度地模拟人类应激状态时的情绪，诱导啮齿类动物产生焦虑、抑郁样行为［10］，具有良好的表观效度、构造效度和预测效度［11］，是抑郁症有效且使用最广的制备模型［12］。本研究采用CUMS刺激建立抑郁症模型后发现，模型组大鼠在旷场实验和高架十字迷宫实验中表现出自主活动能力和探索能力的降低，表明抑郁症模型制备成功。而氟西汀治疗能够显著改善CUMS所致的大鼠运动能力降低及探索行为的减少，表明氟西汀具有改善CUMS大鼠抑郁样行为的作用，与以往的研究结果一致［13］。
Fig.2 Expression levels of NLRP3,ASC and Caspase-1 proteins in hippocampal CA3 area and cortex of rats in each group(immunofluorescence staining, ×200)图2 各组大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白在海马CA3区及皮质区的表达（免疫荧光染色，×200）
Fig.3 Comparison of relative expression levels of NLRP3,ASC and Caspase-1 in brain tissue of rats between the three groups图3 各组大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白相对表达水平的比较
Fig.4 Effects of fluoxetine on TLR4/NF-κB/NLRP3 inflammasome signal pathway of CUMS rats图4 氟西汀对CUMS大鼠TLR4/NF-κB/NLRP3炎症体信号通路的影响
Tab.2 Comparison of expression levels of TLR4,NF-κB,cleaved Caspase-1,NLRP3 and Caspase-1 between the three groups表2 各组大鼠TLR4、NF-κB、cleaved Caspase-1、NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平比较（n=6
Tab.2 Comparison of expression levels of TLR4,NF-κB,cleaved Caspase-1,NLRP3 and Caspase-1 between the three groups表2 各组大鼠TLR4、NF-κB、cleaved Caspase-1、NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平比较（n=6
＊＊P＜0.01；
a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05。
组别对照组模型组氟西汀组F Caspase-1 1.00±0.00 1.42±0.14a 1.07±0.17b 34.212＊＊TLR4 1.00±0.00 1.42±0.27a 1.12±0.21b 16.689＊＊NF-κB 1.00±0.00 1.44±0.33a 0.97±0.19b 16.095＊＊cleaved Caspase-1 1.00±0.00 1.36±0.14a 1.06±0.17b 28.289＊＊NLRP3 1.00±0.00 1.28±0.28a 0.97±0.25b 16.172＊＊
3.2 氟西汀可以抑制CUMS大鼠脑内NLRP3炎症小体的激活 炎症因子在抑郁症的发生发展中发挥着重要的作用，在抑郁动物模型［14］和临床研究［15］中均发现IL-1β和IL-18等炎症因子的表达显著升高。本研究发现，慢性应激可以显著增加大鼠脑组织中IL-1β和IL-18的含量，而氟西汀治疗可以显著降低CUMS大鼠脑组织中IL-1β和IL-18的含量，从而减轻抑郁样行为，进一步说明了降低促炎细胞因子的水平是改善CUMS大鼠抑郁样行为的关键。炎症因子IL-1β和IL-18的分泌与NLRP3炎症小体的激活相关。NLRP3炎症小体是一种调节先天性免疫炎症反应的关键蛋白质复合物，包括NLRP3、ASC和效应蛋白Caspase-1［16］，是目前研究最广泛的炎症小体。NLRP3炎症小体可被应激和细胞因子等刺激激活，诱导IL-1β和IL-18成熟并释放到胞外，从而诱发神经炎症。研究表明NLRP3炎症小体参与了抑郁和焦虑的发病机制［17］；
而且NLRP3基因敲除（NLRP3-/-）能改善小鼠因慢性应激引起的抑郁样行为［14］，可见其是连接慢性应激与抑郁状态之间的关键介质。本研究显示，氟西汀治疗可以逆转CUMS刺激引起的脑组织NLRP3炎症小体相关蛋白的表达上调，并降低脑组织内IL-1β和IL-18的含量，表明氟西汀可抑制NLRP3炎症小体的激活，减少IL-1β和IL-18的成熟和释放，进而改善CUMS大鼠的抑郁样行为。
3.3 氟西汀抑制NLRP3炎症小体的激活与TLR4/NF-κB信号有关 NLRP3炎症小体被激活诱导炎症反应前需要接受启动信号，如TLR4/NF-κB信号的激活，活化的NF-κB进一步上调NLRP3、pro-IL-1β的mRNA转录水平，激活炎症小体，活化的炎症小体诱导IL-1β和IL-18的成熟与释放并启动下游炎症反应。在抑郁症小鼠模型中发现，作为启动信号的TLR4与NLRP3呈现一致的高表达［15］；
而且NF-κB信号与NLRP3炎症小体共同调节IL-1β的转录和功能［18］；
慢性应激可以显著增加海马中TLR4和NF-κB的表达，加重啮齿类动物的抑郁样行为，而敲除TLR4基因可以降低TLR4和NF-κB的表达，改善CUMS所致的抑郁样行为［19］。以上研究表明TLR4/NF-κB信号是诱导NLRP3炎症小体的激活及启动下游炎症反应的关键介质，可能作为抑郁症治疗的新靶点。本研究结果表明CUMS刺激后，TLR4/NFκB信号和NLRP3呈现一致的高表达，而氟西汀治疗又可逆转这种高表达，提示氟西汀可能通过TLR4/NF-κB信号调控NLRP3炎症小体的激活，影响其介导的炎症反应，从而发挥对CUMS大鼠抑郁样行为的保护作用。
综上所述，本研究进一步验证了氟西汀可以改善CUMS大鼠的抑郁样行为，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎症体信号通路的激活，进而减少脑组织中促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟与释放，减轻CUMS所致的炎症反应有关。氟西汀作为一种传统的抗抑郁药物，不仅可以通过选择性抑制5-羟色胺的再摄取治疗抑郁症患者，而且可以通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3炎症体信号通路改善CUMS大鼠的抑郁样行为，为临床治疗抑郁症提供了新的思路和实验依据。
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