王河山，谌赛男，许 文，王英豪，吴水生*
（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；
2.道地药材国家重点实验室，北京 100700）
钩吻Gelsemium elegansBenth.为马钱科钩吻属植物，最早记载于《神农本草经》，亦称胡蔓藤、断肠草、大茶药、猪人参等。全株入药，味辛、苦，性温，有大毒，具有祛风攻毒、散结消肿、止痛的功效［1］。主要分布于福建、广西、广东等地，是我国传统的药用植物，也是世界著名的剧毒药物［2］，因其毒性大，民间多以外用为主。据文献报道，吲哚类生物碱是钩吻的主要化学成分，也是其毒性的主要来源［3］。国内外学者已从钩吻中分离出了17 种生物碱，其中含量最大的是钩吻素子（Koumine），其次为钩吻碱甲（Gelsemine）；
毒性最强的是钩吻素己（Gelsenicine），胡蔓藤碱甲（Humantenmine）次之［4-5］；
而如何减毒增效以提高临床应用也取得了一定进展［6-8］。研究表明，钩吻茎质量占全草的80%，其中老茎中钩吻碱甲、钩吻素子、钩吻素己3 种成分总含量高于嫩茎［9］。
资源调查发现，不同产地的钩吻在长势上存在明显差异，不同生长年限的钩吻也有一定的差异，特别表现在叶片的表面形状和大小以及茎的木质化程度、粗细、颜色等方面［10］。文献已有对钩吻不同部位和产地的生物碱含量进行报道［11］，但是关于不同生长年限的考察报道甚少。近年来，超高效液相色谱（UPLC）串联三重四级杆质谱（QqQMS/MS）因其分离速度快、灵敏度高、测定准确性可靠等优点，被广泛应用在中药及复方的分析中［12-13］。目前有关液质联用分析钩吻药材质量的研究报道还比较少［14-15］。根据前期对钩吻研究，课题组评价了HPLC 外标法测定不同产地钩吻茎中胡蔓藤碱丙等6 个生物碱含量，但分离速度慢、耗时长［16］。因此，本实验采用UPLC-MS/MS 法对6 种生物碱即胡蔓藤碱丙、钩吻碱甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙进行定量分析，比较不同生长年限钩吻的生物碱含量，以期建立快速、简易、准确、高效的钩吻成分定量分析方法［17-20］。为钩吻的种植、采收、加工、研究等资源利用提供理论依据。
1.1 仪器 Waters I-Class 超高效液相色谱串联Micro MS 三重四级杆质谱（美国Waters 公司）；
TCM15D 高速离心机（宁波拓普森科学仪器有限公司）；
225D-1CN 型十万分之一分析天平（德国Sartorius 公司）；
SF180C 型中药粉碎机（湖南中诚制药机械厂）；
KQ2200 台式超声波清洗器（苏州江东精密仪器有限公司）；
Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore公司）。
1.2 试药 4 批不同生长年限钩吻茎药材，在福州市国家森林公园（26°29′01″N，119°16′44″E，H：212 m）同一钩吻植株上进行标记，并连续4 年进行采样，采集的部位以标记处为准，尽量使茎的采集部位保持一致，于每年同一时间采集1 次。经福建中医药大学中药资源与鉴定教研室杨成梓教授鉴定为马钱科钩吻属植物钩吻Gelsemium elegansBenth.的茎。
对照品钩吻碱甲、胡蔓藤碱丙、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙（北京赛百草有限公司）；
乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；
甲醇（色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）；
甲酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；
其他试剂均为分析纯。
2.1 色谱及质谱条件
2.1.1 色谱条件 色谱柱ACQUITY UPLC BEHC18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；
流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～0.5 min，2%A；
0.5～1.5 min，2%～20%A；
1.5～3.0 min，20%～30%A；
3.0～4.0 min，30%～45%A；
流速：0.25 mL/min；
柱温：45 ℃；
进样量：2 μL。
2.1.2 质谱条件 采用电喷雾（ESI）离子源的正离子模式，毛细管电压为3.5 kV，脱溶剂气流为氮气，二级锥孔萃取电压为3.00 V，碰撞气体为氩气，流速为800 L/h，脱溶剂温度200 ℃，锥孔气流为氮气，流速50 L/h，扫描方式为多反应检测模式（MRM）。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液制备 取胡蔓藤碱丙、钩吻碱甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙对照品适量，精密称定，加入甲醇分别制备200.2、226.0、232.0、232.0、212.0、202.0 μg/mL 的单一对照品母液，分别精密量取各母液适量，用50%甲醇稀释配置成单一对照品储备液，系列浓度的各个混标浓度经母液稀释后得到。
2.2.2 供试品溶液制备 取钩吻茎药材粉碎，过50目筛得到钩吻粉末。取钩吻干燥粉末0.2 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇-0.1%甲酸水溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇-0.1%甲酸水溶液补足失重，摇匀，12 000 r/min离心10 min，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。稀释10 倍（即100 μL 提取液加900 μL 的2%乙腈溶剂）后测定。
2.3 方法学考察
2.3.1 质谱测定方法 采用正离子多反应监测（MRM）定量模式，6 种生物碱的质谱分析条件参数见表1。通过钩吻的UPLC-MS/MS 总离子流色谱图，可见钩吻混合标准品和供试品按上述色谱及质谱条件下分析，6种分析物均分离良好。见图1。
表1 6 种生物碱的质谱分析条件参数表
2.3.2 线性和范围 取各对照品储备液，用50%甲醇稀释配制系列梯度浓度的对照品混合溶液，测定前按1∶10 稀释后依法测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，以6 种生物碱浓度（X）为横坐标，作线性回归，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，并以信噪比S/N＝10 为定量限（LOQ），以信噪比S/N＝3为检测限（LOD），见表2。
表2 6 种生物碱检测的回归方程、线性范围、相关系数、LOD 和LOQ
2.3.3 精密度试验 精密量取线性最低浓度点、低、中、高QC 混合对照品溶液1 μL，1 d 内连续进样6次，并连续6 d 测定，根据标准曲线计算其浓度，结果见表3，其日内和日间精密度RSD 范围为1.70%～3.10%，说明仪器精密度良好。
2.3.4 稳定性试验 取本品按“2.2.2”项下制备供试品溶液，分别于0、2、6、10、12、24 h 的时间间隔依法测定，根据标准曲线计算浓度，结果见表3，其RSD范围为3.26%～4.20%，说明样品在24 h 内稳定。
2.3.5 重复性试验 称取同一批钩吻样品6 份，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，依法测定，根据标准曲线计算其含量，结果见表3，其RSD 范围为2.37%～9.92%，说明方法重复性良好。
2.3.6 回收率试验 称取重复性实验同批次已知含量的钩吻样品6 份，各0.1 g，精密加入低、中、高3 个浓度的6 种对照品溶液，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，依法测定，根据标准曲线计算其含量，结果见表3，其回收率平均为98.66%～104.69%，RSD＜6%，说明方法回收率良好。
表3 6 种生物碱检测的精密度、稳定性、重复性和回收率（n＝6）
2.3.7 样品含量测定 分别精密称取不同生长年限的钩吻茎干燥粉末0.2 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱、质谱条件进样2 μL，测定峰面积，根据标准曲线计算其含量，结果见表4。1～4 年6 种生物碱总量的均值分别为1.533、2.688、3.886、4.552 mg/g。随着生长年份增长，钩吻碱甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙的含量均有所增加，6 种生物碱总量也呈现上升趋势。
表4 钩吻不同生长年限样品中6 种生物碱的含量测定（±s） mg/g
表4 钩吻不同生长年限样品中6 种生物碱的含量测定（±s） mg/g
编号S1 S2 S3 S4年限1年茎2年茎3年茎4年茎胡蔓藤碱丙0.156±0.007 0.845±0.031 0.359±0.009 0.255±0.008钩吻碱甲0.499±0.022 0.743±0.017 1.009±0.044 1.325±0.029钩吻素子0.475±0.020 0.385±0.015 1.039±0.028 1.145±0.061钩吻素己0.058±0.004 0.235±0.005 0.216±0.015 0.269±0.014钩吻绿碱0.169±0.006 0.189±0.012 0.663±0.031 0.691±0.017胡蔓藤碱乙0.176±0.008 0.295±0.011 0.600±0.035 0.867±0.027
通过筛选不同色谱柱，比较测定方法的速度、准确性、精密度、重复性、稳定性和回收率等，最终色谱柱ACQUITY UPLC BEHC18在各方法学考察中均表现稳定，故选择为最优色谱柱。此外，在流动相系统选择上，参考许文等［20-21］对三叶青主要成分测定，分析了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水-0.1%醋酸铵水、甲醇-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%醋酸铵水共4 套流动相系统，结果表明乙腈-0.1%甲酸水流动性系统对6 种钩吻生物碱的分离度最佳。另外，通过6 种生物碱的离子质谱裂解图发现，色谱分离上虽然胡蔓藤碱丙和钩吻碱甲或钩吻素己和钩吻绿碱未能明显基线分离，但是其在质谱定量通道MRM 上互不干扰，故两者均可以准确定量。通过Mass Tune 针对待测6 种生物碱成分质谱参数进行优化，考察了最佳的毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量，优选最佳的MRM 模式定量离子对。本试验建立的超高液相色谱法同时测定不同生长年限钩吻中6 种生物碱成分的定量分析方法，为快速、简易、准确综合钩吻的质量评价提供了参考依据。
对不同生长年限的钩吻生物碱含量测定结果表明，1～4 年生钩吻茎中除胡蔓藤碱丙外，钩吻碱甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙等5 种生物碱类成分含量随着钩吻生长年限的增加而增长，并且从6 种生物碱总量来看，随着生长年限的增加，其亦呈现增长的趋势。因此，得出初步实验结论：钩吻随着生长年限的增长，生物碱类成分含量增加，有利于药效成分的富集。
本研究建立的超高效液相色谱法同时测定钩吻不同生长年限（1～4 年）中6 种生物碱成分含量。经方法学验证，检测方法均符合分析要求，同时更简便、快捷、准确、高效，大大缩短了高效液相色谱外标法测定钩吻生物碱成分的时间。本次测定结果显示，不同生长年限（生长年份为1～4 年）的钩吻，在所测定的6 种生物碱中，除胡蔓藤碱丙外，其他5 种生物碱类成分的含量均随钩吻的生长年份增长而增加，生物碱总量也呈逐年上升的趋势。该结果表明钩吻的总生物碱含量在钩吻的生长过程中呈现不断的富集，从药用植物种植、生产及临床应用上进行考虑，老茎的品质可能优于嫩茎，为钩吻的开发应用提供了指导依据。
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