胥爱丽，曹颖男，张素中，邱锦燕，谢灿辉，毕晓黎，肖观林
（1.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095；
2.广州新华学院 药学院，广东 广州 510520；
3.广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095；
4.广州中医药大学 第五临床医学院，广东 广州 510405）
重楼消瘤方由重楼、柴胡、鸡血藤、莪术等中药组成，为临床上应用多年、具有自主知识产权的抗肿瘤中药验方。研究发现其对人肺癌A549细胞在体外具有较高的抑制效果（抑制率> 90%），且能抑制小鼠Lewis肺癌荷瘤模型的肿瘤生长，抗肿瘤效果明显，对于开发高效低价的抗肿瘤传统中药制剂具有重要的意义和价值［1－2］。
中药的疗效与其制剂的质量密切相关，而评价制剂的质量优劣可通过化学成分的含量测定来实现，因此，建立重楼消瘤方与抗肿瘤相关的多成分含量的同时测定方法从而控制制剂质量显得尤为重要。方中君药重楼为百合科植物云南重楼的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛的功效［3］，其主要活性成分为甾体皂苷类，包括重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等。研究表明，重楼皂苷在直肠癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌等多种恶性肿瘤中均表现出良好的抗肿瘤作用［4－5］。臣药柴胡为伞形科植物柴胡的干燥根，主要含有挥发油、皂苷、黄酮等成分［3］。柴胡皂苷是柴胡的主要生物活性成分之一，具有抗肿瘤、抗氧化损伤、抗纤维化和免疫调节等作用［6］。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d均具有较好的抗肿瘤效果，对于肝癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌症均有抑制作用［7－8］。重楼和柴胡的活性成分均为皂苷类，《中国药典》中重楼以重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ为含量测定指标成分，柴胡以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d为指标成分，均采用紫外检测器，但该类成分只在紫外的末端有吸收，故检测波长分别设定为203 nm和210 nm。经实验验证存在明显的末端吸收，基线不稳定，且中药复方制剂的化学成分复杂，在该波长下干扰测定的杂质较多，不适用于复方中皂苷类成分的测定，而蒸发光散射检测器可弥补这些不足［9］。目前，采用二极管阵列检测器或液相色谱－质谱联用技术同时测定重楼药材中的皂苷类成分已有文献报道［10－11］，同时测定柴胡药材中多种皂苷类成分的研究亦有报道［12－13］，但尚无采用超高效液相色谱－蒸发光散射检测器（UPLC－ELSD）同时测定重楼皂苷和柴胡皂苷的报道。蒸发光散射检测器在实际应用和操作中比质谱更易于推广，操作和维护更简便［14－15］。本文采用蒸发光散射检测器对复方制剂中5种皂苷类成分进行同时测定，提高了皂苷类成分含量测定的准确性和检测效率，为重楼消瘤方的质量评价提供了技术支持，为其进一步的深入开发利用奠定了基础。
1.1 仪 器
Agilent 1290超高效液相色谱仪、1260蒸发光散射检测器（美国Agilent公司）；
KQ700－DE型数控超声波清洗机（江苏昆山超声仪器有限公司）；
XS205DU电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。
1.2 材料与试剂
重楼皂苷Ⅰ（批号：111590－201103，纯度92.1%）、重楼皂苷Ⅱ（批号：111591－201103，纯度93.4%）、重楼皂苷Ⅶ（批号：11593－201303，纯度92.5%）、柴胡皂苷a（批号：110777－201108，纯度90.5%）、柴胡皂苷d（批号：11590－201103，纯度96.0%）均购自中国食品药品检定研究院。
乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；
甲醇（分析纯，广州化学试剂厂）；
实验用水为超纯水。
10批重楼消瘤方提取物为自制，分别编号为S1 ~ S10。
1.3 标准溶液的配制
标准储备溶液：分别取柴胡皂苷a、重楼皂苷Ⅶ、柴胡皂苷d、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅰ对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为374.31、443.63、488.06、470.36、355.87 µg/mL的混合标准储备溶液。
标准工作溶液：吸取重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d标准储备溶液0.2、0.5、1、3、5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，混匀，配制成含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分别为7.117 4 ~ 177.94 µg/mL、9.407 2 ~ 235.18 µg/mL、8.872 6 ~ 221.82 µg/mL、7.486 2 ~ 187.15 µg/mL、9.761 3 ~ 244.03 µg/mL的混合标准工作溶液。
1.4 供试品溶液的制备
取重楼消瘤方提取物约1.0 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入10 mL甲醇，称定质量，超声（700 W，50 kHz）处理30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，过0.22 µm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
1.5 UPLC－ELSD色谱条件
色谱柱为Waters Cortecs UPLC C18（150 mm × 2.1 mm，1.6 µm）；
流动相：乙腈（A）－水（B），梯度洗脱：0 ~ 3 min，30% ~ 35% A；
3 ~ 9 min，35% ~ 37% A；
9 ~ 12 min，37% A；
12 ~ 15 min，37% ~ 57%A；
15 ~ 20 min，57% ~ 60% A；
20 ~ 25 min，60% A；
25 ~ 26 min，60% ~ 100% A；
26 ~ 31 min，100%A；
31 ~ 32 min，100% ~ 30% A；
32 ~ 37 min，30% A。流速：0.2 mL/min；
柱温：20 ℃；
漂移管温度：60 ℃；
气体流速：1.5 L/min；
增益：2；
进样量：2 µL。
2.1 样品前处理条件的优化
不同种类、不同极性的有机溶剂对待测组分的提取率影响较大，重楼皂苷和柴胡皂苷均易溶于水、甲醇等溶剂，因此考察了水、甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇作为提取溶剂时的提取效果（见表1）。结果表明，乙醇、70%乙醇对待测成分的提取率较低，70%甲醇次之，水和甲醇的提取率差异较小，但以水为溶剂时待测成分的峰形欠佳，且杂峰较多，因此选择甲醇作为提取溶剂。
表1 不同提取溶剂下5种成分的含量测定结果Table 1 Determination results of 5 constituents in different extract solvents w/（mg·g−1）
提取时间对该复方提取物中5种成分的提取亦有影响。分别考察了超声提取15、30、60 min对5种成分的提取效果，结果显示，提取15 min时5种成分的提取率较低，提取时间为30 min和60 min的提取率无显著差异，即超声提取30 min可将待测组分提取完全。实验选择超声提取时间为30 min。
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 检测器的选择本实验曾尝试采用《中国药典》中柴胡、重楼项下收载的含量测定方法的色谱条件进行实验，采用二极管阵列检测器，检测波长分别为210 nm和203 nm，发现存在明显的末端吸收，杂峰较多，严重干扰待测组分的分离测定（见图1）。考虑到柴胡和重楼中的主要有效成分均为皂苷类，故改用蒸发光散射检测器进行测定，获得了满意的分离效果，去除了杂峰干扰，保证了测定结果的准确性。
5种皂苷类成分标准溶液和代表性样品（S1）的色谱图见图2。对比图1和图2可见，紫外检测器在低波长下杂峰较多，除了有流动相的本底吸收，还有一些几乎无发色团的物质的末端吸收，且吸收较低，干扰较大。而采用蒸发光散射检测器，流动相已在漂移管中被蒸发，因此基线平稳，留下的挥发性较小的粒子在光的折射下才会被检出，ELSD可用于检测不能被紫外吸收的物质，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度相对较低，故含量较低的有紫外吸收的杂质可能在图谱中未能显示，且一些挥发性高于流动相的物质同样会被蒸发而检测不到。因此，对于同样的样品，蒸发光散射检测器的色谱图（图2）与紫外检测器的色谱图（图1）峰数有差异，是由于复方制剂中所含复杂成分的结构性质不同所致。
图1 重楼消瘤方的UPLC－DAD色谱图Fig.1 UPLC－DAD spectra of Chonglou Xiaolou Formula
图2 重楼消瘤方的UPLC－ELSD色谱图Fig.2 UPLC－ELSD spectra of Chonglou Xiaolou Formula
2.2.2 UPLC－ELSD条件的优化蒸发光散射检测器以不含盐、易挥发的溶剂为流动相，故实验采用C18色谱柱，以乙腈－水为流动相即能对5种皂苷类成分进行较好的分离，经过反复多次实验，在“1.5”所述的流动相比例下可将杂质和待测成分较好分离。对ELSD的漂移管温度、喷雾气体流速、增益系数等参数进行优化，结果发现，在漂移管温度为60 ℃，喷雾气体流速为1.5 L/min，增益系数为2，加热模式下，可获得高的灵敏度和响应值。优化的色谱检测条件如“1.5”所示。
2.3 线性关系、检出限与定量下限
将“1.3”配制的混合标准工作溶液分别按照上述色谱条件进行测定，以待测成分质量浓度的自然对数为横坐标（X），对应峰面积的自然对数为纵坐标（Y），绘制标准曲线。由表2可知，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的线性关系良好，相关系数（r）为0.999 2 ~ 0.999 8，线性范围分别为7.117 4 ~ 177.94 µg/mL、9.407 2 ~ 235.18 µg/mL、8.872 6 ~ 221.82 µg/mL、7.486 2 ~187.15 µg/mL、9.761 3 ~ 244.03 µg/mL。分别以信噪比S/N= 3及S/N= 10计算该方法的检出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到5种成分的检出限为0.7 ~ 1.0 µg/mL，定量下限为1.8 ~ 2.4 µg/mL，表明本方法的灵敏度良好。
表2 5种成分的线性关系、检出限及定量下限Table 2 Linear relationships，limits of detection and limits of quantitation of 5 components
2.4 精密度
精密吸取供试品溶液（S1）2 µL，注入液相色谱仪中，按“1.5”色谱条件连续进样6次，计算得到重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.3%、1.5%、1.3%、0.50%、1.8%，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性
取同一批提取物（S1），分别于0、2、4、8、12、18 h进样测定，计算得到上述5种成分峰面积的RSD分别为0.78%、1.2%、1.9%、0.25%、1.8%，表明供试品溶液在18 h内的稳定性良好。
2.6 重复性
取同一批提取物（S1），按“1.3”制备6份供试品，按“1.5”色谱条件依次进样测定，计算得到上述5种成分峰面积的RSD分别为0.98%、1.7%、1.0%、1.6%、2.1%，表明方法的重复性良好。
2.7 回收率与相对标准偏差
取同一批提取物（S1）约0.5 g，平行处理9份，分别精密加入3个质量浓度的混合对照品溶液10 mL，制备供试品溶液并依次测定。计算得到上述5种成分的平均加标回收率分别为93.9%、103%、102%、104%、105%，RSD分别为3.8%、4.0%、4.2%、3.6%、3.2%（见表3）。
表3 样品中5种成分的加标回收率及相对标准偏差（n = 9）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of 5 components in samples（n = 9）
2.8 实际样品检测
取10批重楼消瘤方提取物，按照本方法制备供试品溶液并进行测定，计算样品中5种待测物的含量（见表4）。由表4可知，10批自制重楼消瘤方提取物中均检出重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，含量分别约为0.17 ~ 0.19 mg/g、0.10 ~ 0.12 mg/g、0.35 ~ 0.37 mg/g、1.37 ~1.49 mg/g、0.17 ~ 0.18 mg/g。结果表明该复方提取物的10批样品之间差异较小，批次间的质量较稳定，说明该方原料质量控制严格，制备工艺稳定。
表4 10批样品中5种成分的含量测定结果（mg/g，n = 3）Table 4 Determination results of 5 constituents in ten batches of samples（mg/g，n = 3）
本文采用超高效液相色谱－蒸发光散射检测器建立了重楼消瘤方提取物中5种皂苷类成分同时测定的分析方法，可消除紫外检测器末端吸收的干扰，5种成分的平均回收率为93.9% ~ 105%，相对标准偏差为3.2% ~ 4.2%。将本法用于10批复方制剂样品的测定，发现批间差异较小。该方法分析快速、操作简便、准确可靠、灵敏度高，可同时定量分析复方制剂中的5种皂苷类成分，对于重楼消瘤方的质量评价具有指导意义。
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