刘慧香，李启艳，牛水蛟，刘莹，崔玉花，于海英
（山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局化妆品原料质量控制重点实验室，济南 250101）
玉竹为百合科植物玉竹的干燥根茎[1]，广布于欧亚大陆温带地区，其生长于我国大部分省区。野生玉竹主产于我国东北三省及内蒙古地区，又称为“关玉竹”。种植玉竹主产于湖南、浙江、广东、贵州、江西等地，产于湖南的“湘玉竹”产量大，品质好[2]。玉竹最早以葳蕤之名载于《神农本草经》，1963年开始载入《中国药典》。《中国药典》记载玉竹味甘，性微寒，归肺经、胃经。玉竹养阴润燥，生津止渴，主治肺胃阴伤，燥热咳嗽，咽干口渴，内热消渴[1]。2002 年卫生部将玉竹纳入药食同源物品名单。如今玉竹不仅作为配伍药材应用于中药处方，在民间食疗、保健方面应用也非常广泛，如玉竹茶、玉竹饮料均深受欢迎[3-5]，另外玉竹多糖也可与甘油协同使用制备保湿护肤品[6-7]。
现代研究表明，玉竹中含有多糖、甾体皂苷、黄酮、生物碱、强心苷等多种成分，玉竹多糖为其主要活性物质[8-9]。文献调研表明，玉竹增强免疫活性、辅助降血糖、辅助降血脂、抗氧化、抗疲劳等多种功效均与玉竹多糖密切相关，其中多糖的单糖组成、糖苷键类型及空间结构均会影响其生物活性[10-17]。玉竹多糖主要由果糖、葡聚糖、甘露糖等聚合而成，如玉竹黏多糖和玉竹果聚糖。研究表明玉竹多糖含量(质量分数)一般为6.51%～10.27%[18]。玉竹多糖含量受产地、生长年限、采收时间等因素影响，湖南产的玉竹多糖含量较高，野生品玉竹多糖含量高于栽培品，三年生玉竹多糖含量高于两年生玉竹，且三年生9 月下旬至10 月上旬采收的玉竹多糖含量最高[19]。中药多糖由于其分子量大、缺乏发光基团，《中国药典》多采用硫酸-苯酚法或硫酸-蒽酮法进行测定，另有采用液相色谱法和气相色谱法测定多糖水解后单糖组成及含量[20]。比色法简便易行，其准确度受待测多糖单糖组成的影响；
色谱方法选择性好，但操作繁琐，对仪器设备要求较高。
笔者建立了硫酸-苯酚法测定玉竹药材中多糖，并重点分析了提取方法、沉淀用醇的浓度和沉淀时间对多糖含量测定结果的影响。与药典方法相比，样品处理省去了浓缩步骤，提取过程更简便高效；
醇沉淀时间适当延长，使多糖沉淀更完全，测定结果更加稳定、可靠。该法可为玉竹药材的质量控制提供数据支撑。
1.1 主要仪器与试剂
电子分析天平：MS105DU 型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
紫外分光光度计：TU1901 型，北京普析通用公司。
离心机：TDZ5-WS 型，长沙湘仪离心机仪器有限公司。
涡旋混合器：XK96-B型，姜堰市新康医疗器械有限公司。
浓硫酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
苯酚溶液：0.04 g/mL，准确称取4.0 g苯酚固体，加少量蒸馏水溶解，移至100 mL 容量瓶中，加水定容至标线，避光保存。
葡萄糖对照品：纯度（质量分数）为100%，中国食品药品检定研究院。
葡萄糖标准储备液：600 µg/mL，精确称取干燥至恒重的葡萄糖对照品60.00 mg，加水溶解并定容至100 mL容量瓶中。
无水乙醇：分析纯，天津市康科德科技有限公司。
玉竹样品：共收集19批玉竹药材，其中7批来自湖南，编号为YZ-1-7；
3 批来自广东，编号为YZ-8-10；
3批来自东北，编号为YZ-11-13；
5批来自浙江，编号为YZ-14-18；
1 批来自河北，编号为YZ-19。以上药材均经山东中医药大学田景振教授鉴定为百合科植物玉竹的干燥根茎。经干燥、粉碎、过筛后，保存于干燥器中备用。
实验用水为超纯水。
1.2 实验方法
1.2.1 标准工作曲线的绘制
分别精密量取葡萄糖标准储备液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，用水稀释至标线。精密量取上述各溶液2 mL，另取蒸馏水2 mL 作空白对照，置于具塞试管中，加入苯酚溶液1 mL，混匀，迅速加入硫酸7.0 mL，摇匀。于40℃水浴中保温30 min，取出，置冰水浴中5 min，取出，以相应试剂为空白，用紫外分光光度计测定490 nm波长的吸光度值。以溶液的质量浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准工作曲线。
1.2.2 样品测定
取玉竹样品粗粉约l g，精密称定，每个样品平行取2份，置于平底烧瓶中，加入水100 mL，加热回流1 h，趁热过滤，至100 mL容量瓶中，加水至标线，摇匀，精密量取2 mL，置于50 mL容量瓶中，加入无水乙醇8 mL，摇匀，置于冰箱中于4 ℃静置12 h，离心，弃去上清液，加水定容至标线，摇匀，得玉竹多糖样品溶液。精密量取玉竹多糖样品溶液2 mL，按照1.2.1 方法，自“加入苯酚溶液 l mL”起，依法测定吸光度，以标准曲线法得到溶液中葡萄糖质量（µg），并计算玉竹样品中多糖的含量。
2.1 测定波长的确定
取葡萄糖标准溶液和玉竹多糖样品溶液，经苯酚-硫酸法处理后，于200～800 nm 波长范围内进行光谱扫描，获得吸收曲线见图1。由图1 可知，葡萄糖在490 nm 波长处有最大吸收，玉竹多糖样品在488 nm波长处有最大吸收，两者最大吸收波长较为接近，符合药典规定的试样最大波长允许误差范围，故确定测定波长为490 nm。
图1 溶液的紫外吸收曲线
2.2 样品处理
2.2.1 提取方法的选择
试验考察了加热回流、加热煮沸及超声提取对玉竹样品中多糖含量测定值的影响。精密称取玉竹样品1 g，平行称取9份，加水100 mL，其中3份加热回流1 h，3 份煮沸1 h，3 份超声提取1 h，其余按照1.2.2方法测定，结果列于表1。
表1 不同提取方法玉竹样品中多糖含量测定结果 %
对表1中试验数据采用进行t检验统计分析，结果表明，加热回流和加热煮沸得到的玉竹多糖含量测定值无显著差异（P＞0.05），而超声提取得到的玉竹多糖测定值明显低于前两种方法（P＜0.05），可能由于超声提取温度较低，溶液中多糖不能得到充分提取，最终确定提取方法为加热回流。
2.2.2 乙醇浓度的选择
玉竹样品经一定浓度乙醇溶液沉淀将多糖分离后，消除了可溶性单糖、低聚糖及其它杂质的干扰。不同的乙醇浓度对多糖的提取率有一定影响。戴平等研究了不同醇沉浓度对广西莪术多糖含量的影响，发现使用75%（体积分数，下同）的乙醇较为适宜[21]。试验考察了不同浓度乙醇对玉竹多糖含量测定值的影响，比较了体积分数分别为79%（药典方法）、70%、75%、78%、80%、82%、85%、90%乙醇对玉竹多糖测定值的影响，不同浓度乙醇对应的玉竹中多糖含量测定结果见图2。
图2 不同浓度乙醇对应的玉竹中多糖含量测定值
由图2可知，随着乙醇浓度的升高，玉竹多糖含量测定值呈上升趋势。当乙醇的体积分数达到85%、90%时，多糖含量测定值明显增高，但当乙醇的体积分数不大于82%时，获得的沉淀是无色透明胶状物，而乙醇的体积分数为85%、90%时，沉淀物渐变为白色固体。高浓度乙醇获得的沉淀中可能掺杂有其它物质，导致测定结果偏高，这有待于结合紫外扫描进一步确证。综合多糖含量测定值及沉淀状态，最终确定乙醇溶液体积分数为80%。
2.2.3 沉淀时间的选择
试验考察了乙醇沉淀0 h 和12 h 对玉竹多糖含量测定结果的影响。精密称定本品1 g，平行称取6份，进行加热回流提取。分别取多糖试液2 mL加无水乙醇8 mL，其中3份摇匀后立即离心，另3份摇匀后置于冰箱中于4 ℃放置12 h，其余按照1.2.2 方法测定，不同沉淀时间对应的玉竹多糖含量测定结果见表2，经t检验统计分析，结果表明，用乙醇于4 ℃沉淀12 h得到的玉竹多糖含量测定值显著高于搅拌离心处理后的玉竹多糖含量测定值（P＜0.05），因此确定沉淀时间为12 h。
表2 不同沉淀时间对应的玉竹多糖含量测定结果
2.3 线性关系
按照1.2.1 方法建立标准工作曲线，线性范围、线性方程及相关系数见表3。由表3可知，葡萄糖在0～120 µg质量范围内线性关系良好，线性相关系数为0.999 6。
表3 线性范围、线性方程、相关系数
2.4 检出限
参照GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法理化部分 总则》附录A相关规定：检出限为3倍空白值的标准偏差（测定次数n≥20）相对应的质量或浓度，吸光光度法按国际理论与应用化学家联合会规定计算。方法检出限试验数据见表4。由表4 可知，该方法检出限为0.91 µg。
表4 方法检出限试验数据
2.5 精密度试验
精密称定同一编号混合均匀的玉竹药材粉末6份，按照1.2.2方法测定，试验结果见表5。由表5可知，6 份样品玉竹多糖含量测定值的相对标准偏差为1.15%，表明该方法精密度良好。
表5 精密度试验结果 %
2.6 稳定性试验
按照1.2.2方法，分别于样品制备完成后0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h 测定吸光度，试验结果见表6。由表6 可知，显色后的溶液在6 h 内吸光度基本不变，测定结果的相对标准偏差为0.81%，表明显色后溶液在6 h内较为稳定。
表6 稳定性试验结果
2.7 加标回收试验
分别称取已知含量的玉竹药材粉末9份，分为3组，每组3 份样品，每份约0.5 g，按照低、中、高3 个水平分别加入一定量的葡聚糖对照品，按照1.2.2方法进行提取、测定，测定结果见表7。由表7可知，葡萄糖平均加标回收率为95.9%～98.6%，表明该方法准确度较高。
表7 加标回收试验结果
建立了测定玉竹药材中多糖含量的方法，对提取方法、醇沉浓度、醇沉时间分别进行了优化，最终确定加热回流提取、80%乙醇过夜进行沉淀。以葡萄糖为对照，采用苯酚-硫酸法进行比色测定。该方法具有操作简便、稳定性好、回收率高、经济实用的优点，且不要求大型仪器，对于玉竹种植者，可以减少检测成本、实用性更强。
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