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针刺腧穴“降压方”对自发性高血压大鼠ACEAngⅡ-AT1R轴及Profilin-1的影响*

时间:2024-01-16 13:15:01 来源:网友投稿

张 铭 董爱爱 冀雨芳 崔依依 李盼丽 郭继龙△

(1.山西中医药大学分子中医药学国家级国际联合研究中心,山西 太原 030024;
2.山西中医药大学中医脑病学山西省重点实验室,山西 太原 030024;
3.河北省保定市第一中医院,河北 保定 071000)

近年来随着生产生活水平的逐步提高、人口老龄化速度的逐渐加快,人们生存压力不断增大,饮食、作息时间不规律,且大量摄入高脂、高盐、高糖饮食又缺少锻炼,导致我国被诊断为原发性高血压的患者逐年增加。长期血压的增高使人的情绪易激动,行为习惯、日常活动发生改变。随着高血压的发生、发展,会产生一系列严重并发症,如心脑血管疾病、肾脏病变等[1],不仅给人们的日常生活造成严重的影响,而且长期服药会给患者带来沉重的经济负担。临床报道中医针刺有良好的降压作用[2]。韩玉慧等[3]通过计量分析发现针刺治疗自发性高血压大鼠(SHR)效果显著,为针刺治疗原发性高血压方面提供了参考。基于课题组对全国名老中医冀来喜的腧穴“降压方”的针刺研究[4],笔者采用SHR模型,探讨针刺腧穴“降压方”是否通过影响血管紧张素转化酶(ACE)-血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)-血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)轴及前纤维蛋白-1(Profilin-1)来实现降压。现将结果报告如下。

1.1 实验动物

选取30只体质量250~290 g的12周龄清洁级雄性SHR,选取15只同周龄、同性别、相似体质量的清洁级WKR,实验中所用大鼠全部购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号:SCXK(京)2016-0006],饲养于山西中医药大学动物实验室。在适宜的环境中适应性喂养1周,温度22~25℃,相对湿度45%~65%,通风、光照良好,室内清洁安静。所有大鼠均自由摄食、饮水,饮水瓶每日均予以消毒更换。大鼠垫料每3日更换1次。饲养和操作符合山西中医药大学实验动物伦理委员会规定。

1.2 仪器与试剂

大鼠无创血压测量系统(泰盟有限公司,BP-600A),一次性无菌针灸针(北京太和医疗器械有限公司,规格:0.22 mm×25 mm);
超级恒温水浴箱(成都泰盟软件公司,型号:HW-500),高速台式离心机(安徽中科中佳科学仪器公司,型号:HC-3018),病理切片机(湖北省孝感市亚光医用公司,型号:YGQ-3),石蜡包埋机(湖北省孝感市亚光医用公司,型号:YB-6LF),生物显微镜(重庆市澳浦光电公司,型号:UB102i);
不同浓度酒精(货号:G1114)、复合消化液(货号:G1006)、PBS缓冲液(货号:G1006)、二甲苯(货号:G1114)、二抗羊抗兔IgG-HRP(货号:814)均购自Servicebio;
AngⅡ ELISA试剂盒(货号:EK0585)、ACE ELISA试剂盒(货号:EK0585);
SABC免疫组化染色试剂盒(货号:EK0585);
DAB底物显色试剂盒(货号:EK0585)均购自BOSTER。

1.3 分组与干预

将30只SHR按随机数字表法分为模型组15只、针刺组15只,另外15只WKR作为正常对照组,并编号标记。针刺组针刺腧穴“降压方”:人迎穴、曲池穴、足三里穴(双侧)。取穴:人迎穴[两侧下颌骨髁突连线下(8.00±0.30)mm,前正中线旁开(5.50±0.40)mm][5],直刺(5.00±0.20)mm;
曲池穴[桡骨近端的关节外侧前方凹陷中][6],直刺(4.00±0.50)mm;
足三里穴[位于后腿外侧,略低于膝盖,胫骨嵴的外侧中间,约在胫骨和腓骨腹侧肌肉的中间部位,在腓骨小头下约5 mm处][6],直刺(7.00±0.50)mm。模型组随意在大鼠躯干部位针刺,针刺手法和针刺组相同。对照组无针刺干预,其他操作和另外两组相同。实验中留针30 min,每间隔10 min行针1次,轻微提插捻转,每次1 min。周一至周六每天干预1次,周日休息进行测血压、记录行为变化,持续4周。

1.4 观察指标

1.4.1 血压 采用尾压测量法:在适宜的环境中使大鼠尾动脉充分扩张,于大鼠安静状态下应用BP-600A泰盟全自动无创血压测量系统测量。如果测量过程中出现大鼠活动使血压波形紊乱,需要重新测量,最终血压值是在大鼠稳定状态下连续测量3次求取的平均值。血压测量均在周日12∶00~16∶00进行。

1.4.2 行为变化 由3位课题组成员分别对实验中的所有大鼠进行打分和记录,最后对3组的记分结果进行统计分析。一般行为观察:毛色光泽、摄食量、饮水量、二便形态等,每日观察并做记录。易激惹程度[7]:1分为捉拿颈部时尖叫、惊跳;
2分为捉持颈部时愤怒、欲咬人;
3分为提拿尾部时即出现尖叫、惊跳,甚至欲伤人或同笼大鼠频繁撕咬,或啃咬鼠笼。上述情况不明显者为0分,每周测量血压时记录。

1.4.3 AngⅡ、ACE含量 针刺结束后禁食给水,麻醉下行腹主动脉取血5 mL,将血清放置2 h后,以3 000 r/min离心15 min,用塑料离心管分装,按照ELISA试剂说明书方法测定大鼠血清中AngⅡ、ACE的含量。

1.4.4 AT1R、Profilin-1表达 剪取约0.5cm胸主动脉放入包埋框中,清水冲洗后乙醇脱水,二甲苯透明后浸蜡、包埋、切片。二甲苯脱蜡后,H2O2灭活内源性酶、消化液抗原修复,5%BSA封闭孵育盒,滴加稀释的一抗(AT1R配置比例为1∶100 PBS液;
Profilin-1配置比例为1∶500 PBS液)。在4℃环境中过夜后滴加生物素标记羊抗兔IgG,常温放置30 min后擦去多余液体,滴加SABC,DAB显色。在显微镜400倍镜下观察,出现棕黄色颗粒为阳性表现,运用Image-ProPlus6.0系统图像对图片进行统计处理,随机选取5个视野测定每张切片的平均光密度值(IOD)。

1.5 统计学处理

应用SPSS22.0统计软件处理。正态分布的计量资料以()表示,采用单因素方差分析;
等级资料采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 各组大鼠不同时间血压变化的比较

见表1。针刺前与对照组相比,模型组、针刺组收缩压(SBP)及舒张压(DBP)均升高,差异有统计学意义(P<0.05);
模型组和针刺组相比差异无统计学意义(P>0.05)。针刺1周后,与针刺相比,模型组血压有所升高,针刺组血压有所下降,差异无统计学意义(P>0.05);
针刺组与模型组相比,SBP及DBP均稍有下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。针刺2周后,与针刺前及针刺1周后相比,模型组SBP及DBP逐渐上升,针刺组SBP及DBP逐渐下降,差异无统计学意义(P>0.05);
针刺组与模型组相比,SBP及DBP均呈现显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。针刺3周及4周后,针刺组与模型组相比,SBP及DBP均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠不同时间点SBP、DBP水平比较(kPa,±s)

表1 各组大鼠不同时间点SBP、DBP水平比较(kPa,±s)

注:与对照组同时期比较,*P<0.05;
与模型组同时期比较,△P<0.05。下同。

组别对照组(n=15)模型组(n=15)针刺组(n=15)时间针刺前第1周第2周第3周第4周针刺前第1周第2周第3周第4周针刺前第1周第2周第3周第4周SBP 16.89±2.52 16.62±2.32 16.91±2.66 16.60±2.92 16.226±2.56 24.91±1.77*25.12±1.98*25.34±1.93*25.65±1.99*25.84±1.82*25.17±1.81*23.78±2.70*23.07±2.58*△21.12±2.80*△19.28±3.01*△DBP 13.04±1.98 12.76±2.05 12.91±1.99 12.61±1.88 12.23±2.43 19.72±2.21*19.79±2.63*19.98±2.05*20.19±1.87*20.39±1.81*19.85±2.48*19.39±2.90*18.51±2.44*△17.67±2.27*△16.53±2.08*△

2.2 各组大鼠行为变化的比较

见表2。对照组大鼠状态较好,表现为毛色有光泽鲜亮,摄食、饮水量充足,淡黄色小便,颗粒状大便软硬适中。模型组大鼠毛色暗淡无光泽,摄食、饮水量减少,掉毛较多,小便颜色较深且量少,大便稀薄或不能成形,量少。针刺组大鼠毛色欠光泽,但掉毛较模型组少,且摄食、饮水量较模型组增加,二便基本同对照组。实验前,模型组和针刺组大鼠警惕、应激状态明显,同笼间经常有打斗、撕咬现象,评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);
针刺组和模型组易激惹程度相当,差异无统计学意义(P>0.05)。在实验过程中,模型组大鼠持续表现为应激、狂躁、易激惹状态,啃咬鼠笼、双后肢站立和同笼大鼠间打斗等现象,并可见外抓伤。针刺组大鼠在针刺前和针刺1周时,与模型组表现相似,针刺时挣脱现象明显,差异无统计学意义(P>0.05);
针刺2周后,顺从性好转,激惹程度下降,与其他两组相比差异无统计学意义(P>0.05);
从第3至4周结束时,激惹程度持续下降,与同期模型组评分相比,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠易激惹程度评分比较(分,±s)

表2 各组大鼠易激惹程度评分比较(分,±s)

组别对照组模型组针刺组n 15 15 15针刺前0.79±0.25 1.60±0.36*1.66±0.27*第1周0.82±0.27 1.73±0.38*1.71±0.35*第2周0.85±0.27 1.78±0.42*1.57±0.37*第3周1.02±0.39 1.82±0.36*1.21±0.28△第4周0.93±0.32 1.79±0.43*1.02±0.33△

2.3 各组大鼠血清中AngⅡ、ACE含量比较

见表3。针刺4周后,模型组与对照组相比,ACE、AngⅡ含量明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);
针刺组较模型组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表3 各组大鼠针刺4周后血清AngⅡ、ACE含量比较(pg/mL,±s)

表3 各组大鼠针刺4周后血清AngⅡ、ACE含量比较(pg/mL,±s)

组别对照组模型组针刺组n 15 15 15 ACE 15.98±6.45 55.21±7.58*30.90±6.04△AngⅡ96.21±18.78 221.28±31.84*177.38±26.64△

2.4 各组大鼠主动脉组织中AT1R、Profiin-1表达比较

见表4、图1。针刺4周后,模型组与对照组相比,AT1R、Profiin-1阳性表达明显增多,差异具有统计学意义(P<0.01);
针刺组阳性表达较模型组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。

图1 各组大鼠主动脉AT1R、Profilin-1免疫组化(400倍)

表4 各组大鼠主动脉组织AT1R及Profilin-1的表达比较(±s)

表4 各组大鼠主动脉组织AT1R及Profilin-1的表达比较(±s)

组别对照组模型组针刺组n 15 15 15 AT1R 0.35±0.03 0.87±0.08*0.68±0.05△Profilin-1 0.27±0.03 0.72±0.08*0.53±0.04△

原发性高血压的病名在中医古籍中没有相关记载,根据其临床表现可归于“头痛病”“眩晕病”等,在临床应用中针刺治疗高血压的取穴多集中于多气多血的手足阳明经上。实验前笔者对冀来喜教授的腧穴“降压方”组成进行资料查询发现,人迎穴、足三里穴、曲池穴单穴降压效果明确:针刺人迎穴降压的机制可能与其周围有丰富的神经分布有关,进而影响神经信号传导来达到降压目的[8]。张红星等[9]通过临床观察发现针刺曲池穴降压起效时间明显早于舌下含服硝苯地平片;
针刺足三里穴可抑制交感神经兴奋性而发挥其降压作用[10]。关于针刺降压腧穴处方,以石学敏院士的“活血散风,疏肝健脾”降压针刺法降压疗效确切,又可减轻靶器官的损害,为临床针刺降压提供依据[11],并兼有潜在抗焦虑、抗抑郁而达到降压目的的作用[12],体现了中医针刺的整体调节作用。

本实验研究表明针刺1周时,模型组血压较针刺前升高,针刺组血压较针刺前有所下降,说明针刺腧穴“降压方”可以降低血压;
在针刺2周后,模型组SBP及DBP持续上升,针刺组血压逐渐下降且两组相比针刺组SBP及DBP均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),说明连续针刺腧穴“降压方”可使血压持续降低;
针刺第3、4周后,针刺组与模型组相比,SBP及DBP均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。从上述结果可以看出连续针刺腧穴“降压方”可在第2周后平稳持续降低SHR的血压。针刺过程中一般行为观察结果表明:针刺前模型组、针刺组、对照组3组相比,模型组和针刺组较对照组表现出明显的警惕、应激状态,且同笼中经常有打斗、撕咬等现象,毛色光泽度、摄食、饮水量也有明显差异。针刺组在针刺前和针刺1周后,与模型组表现相似,无明显区别;
针刺组针刺2周后,顺从性好转,激惹程度下降;
针刺结束时,针刺组激惹程度明显下降,与模型组相比有统计学意义(P<0.05),说明模型组出现了易激惹程度高的病理行为改变。以上结果表明针刺腧穴“降压方”可以改善高血压一般行为特征。激惹程度增高是SHR交感亢进的病理行为学表征。屈会化等[7]研究显示,高血压治疗的疗效可以从SHR宏观表征和行为学改变更全面的反映出来。张志国等[13]通过SHR动物实验研究表明,长期血压控制不佳易引起脑组织损伤,造成认知功能障碍,并可引起行为改变。这些均与本实验研究结果一致。

原发性高血压的发病机制目前尚未完全明了,其中ACE、AngⅡ参与的对血压调节有关键性作用[14]的RAAS是高血压的主要发病机制之一。血压的升高与RAAS的激活有直接关系,其中在心血管和血压调节中起关键作用的ACE-AngⅡ-AT1R轴是RAAS的经典途径。近年来实验已证明RAAS系统中的核心活性肽AngⅡ在自发性高血压大鼠血压变化的病理生理过程中有重要意义[15],随着AngⅡ含量的增加血压也在升高,AngⅡ的含量取决于ACE及其受体AT1R。对比本实验各组大鼠的AngⅡ含量,发现针刺4周后,针刺组与模型组相比有显著差异,这说明针刺腧穴“降压方”的降压机制与AngⅡ密切相关。广泛分布于体内的激肽酶ACE通过转化或降低酶活性使血浆和组织中的AngⅡ含量增加[16],进而激活RAAS使血压升高。本实验中模型组的ACE含量较对照组明显升高,针刺4周后,针刺组的ACE含量较模型组下降幅度明显,说明针刺腧穴“降压方”可能是通过降低ACE、AngⅡ含量,进而抑制了RAAS的活性,达到使血压下降的目的。

现已证明AngⅡ的大部分生理病理过程是通过AngⅡ受体AT1介导,并且该亚型在AngⅡ诱导的血管功能中起到主要作用[17]。本实验通过免疫组化方法检验各组大鼠AT1R的阳性表达,其中模型组较对照组棕黄色阳性表达十分明显,说明AT1R在SHR主动脉中表达强烈,针刺4周后,针刺组较模型组棕黄色颗粒明显减少,说明针刺腧穴“降压方”是通过调节AngⅡ受体含量达到降压的效果。在调节血管功能中起着重要作用的前纤维蛋白Profilin-1是一种小分子量的肌动蛋白的结合蛋白,从本实验的结果可以看出模型组的阳性表达明显增多,说明随着血压的升高,血管功能降低,在针刺4周后,针刺组较模型组阳性表达降低,说明针刺腧穴“降压方”能够影响血管功能。

本实验所选用的动物模型是生长过程与人类原发性高血压发展过程有很多相似之处的SHR,12周龄时的SHR出现外周阻力升高说明其存在小动脉硬化的病理损伤[18],此时不仅需要降压,还需要降低外周阻力,临床高血压也多处于此期。选用不具备高血压特征且血压稳定与SHR同一品系的WKR作为正常对照组,通过观察血压及其行为的变化,分析评价针刺效果,实验结果可为临床应用提供依据。

本研究结果表明,针刺腧穴“降压方”降压效应明确,降压机制可能是通过调节ACE-AngⅡ-AT1R轴及Profilin-1实现的。

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