牛泽家馨 ,杜鸣飞 ,胡桂霖 ,张 玺 ,王 丹 ,王 兰 ,罗文婧,常鸣珂,邹 婷,张晓玉,严 瑜,褚 超,廖月圆,马 琼,王科科,贾 昊,陈 晨,孙 月,郭统帅,张 婕,高卫华,满子悦,高 可,牟建军,汪 洋,6
(1.西安交通大学第一附属医院心内科,陕西西安 710061;2.西安国际医学中心医院心内科,陕西西安 710100;3.西北妇女儿童医院心内科,陕西西安 710003;4.西安市人民医院心内科,陕西西安 710004;5.西安市第一医院心内科,陕西西安 710002;6.西安交通大学全球健康研究院,陕西西安 710061)
高血压是心血管疾病的重要危险因素,可造成心肌梗死、心力衰竭、脑卒中、慢性肾脏病等严重并发症,是危害全球人类健康的重要公共问题之一[1]。目前研究认为,高血压的发生发展受遗传和环境因素的相互作用[2-3]。环境因素中钠摄入过多与钾摄入量不足是促进高血压发生的重要环境因素[4-5],同时,大量证据显示不同个体的血压对饮食中钠钾摄入的反应性存在显著差异[6-7],这表明个体因遗传背景的不同,其血压对于钠敏感性及钾敏感性不尽相同。因此,探索影响血压的钠钾敏感性的遗传变异有助于阐释血压调节机制并为高血压防治提供新思路。
神经前体细胞表达发育下调的4 样蛋白(NEDD4L)是一种E3泛素蛋白连接酶,参与底物识别及泛素化[8-9]。NEDD4L 在机体钠稳态及血压调节中发挥重要作用,其WW 功能域与肾小管上皮的钠通道蛋白(ENaC)亚基的PY 功能域相互作用可致泛素化进而被内吞降解,从而减少肾脏对钠的重吸收,有效防止水钠潴留,避免血压升高[10]。在人群中的一种特殊高血压类型—Liddle综合征,就是一个重要证据,该种疾病是由于ENaC 突变后无法被NEDD4L泛素化而内吞,导致钠重吸收增多,血压升高,说明NEDD4L 在血压及钠的调节中起重要作用[11]。NEDD4L基因位于人类染色体18q21,该基因位点区域是调控原发性高血压、家族性体位性低血压、体位变化导致的收缩压变化等的重要基因定位区[12]。另外,不少研究表明,NEDD4L rs4149601 G等位基因携带者比A 等位基因携带者的ENaC 表达更多且钠重吸收明显增加,并且携带至少1 个rs2288774的C等位基因的受试者血压水平更高[13],上述研究提示NEDD4L基因与血压水平调节密切相关。然而关于人群中NEDD4L的基因多态性与血压的钠钾反应性的关系尚未见报道。因此,本研究基于既往在陕西建立的“盐敏感高血压研究队列”,通过对人群进行饮食钠钾干预,探讨NEDD4L 基因多态性与血压钠钾反应性的关系。
1.1 研究对象
于2003年10月-2004年10月在陕西宝鸡市眉县多个农村汉族人群中招募来自124个家系的514名受试者,建立了“盐敏感性高血压研究队列”。受试者年龄为18～60岁、收缩压 在130～160 mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)和(或)舒张压在85～100 mm Hg 范围内,具体纳入及排除方法已在本课题组以往相关文献中详细报道[14-15]。本研究已通过西安交通大学第一附属医院伦理委员会审批,受试者均知晓研究内容并签署知情同意书。
1.2 基线调查及饮食干预
对入组的333名除先证者父母外的受试者进行慢性盐负荷及补钾干预试验[14-15],具体流程分为四个阶段:3 d基线调查期、7 d低盐饮食期(每天3 g氯化钠或51.3 mmol钠)、7 d高盐饮食期(每天18 g氯化钠或307.8 mmol钠)和7 d高盐补钾期(每天在高盐饮食基础上再加60 mmol钾或4.5 g氯化钾)。基线期调查问卷主要包括年龄、性别、身高、体重、体质指数(BMI)、腹围、收缩压、舒张压等基本资料。
1.3 血压测量
采用随机零点血压计(Hawksley&Sons,英国)分别于固定时间测量血压,即在基线期和钠钾干预期的第5、6、7天按标准方法测量血压,每次重复测量血压3次,采用9次血压的平均值进行最终统计分析。计算公式为:平均动脉压=舒张压+1/3(收缩压-舒张压),脉压差=收缩压-舒张压。本研究中将血压对钠钾的反应性当作连续性变量,计算公式为:低盐期血压反应性=低盐期血压-基线期血压;高盐期血压反应性=高盐期血压-低盐期血压;补钾期血压反应性=高盐补钾期血压-高盐期血压。
1.4 血、尿标本的收集与分析
分别于固定时间采集血尿标本,在基线期及各干预阶段的最后1 d采集受试者的外周静脉血标本和24 h尿标本。于清晨采集4 mL空腹静脉血为血标本,离心机的半径为16 cm,转速3 000 r/min离心15 min,将分离的血清标本存放在-80℃冰箱冷冻保存备用检测。24 h 尿液标本采集全天尿液并测量记录尿量,分别吸取4 mL 尿标本存放于2个冻存管内,存于-40℃冰箱待检。采用Hitachi7060全自动生化分析仪(日立,日本)检测尿标本中钠、钾浓度以及血标本的生化指标(包括血肌酐、甘油三脂、总胆固醇、血糖等)。计算公式为:钠排泄量=24 h尿液总体积×尿钠浓度;钾排泄量=24 h尿液总体积×尿钾浓度。
1.5 SNP位点选择及基因分型
分别对美国国家生物技术信息中心数据库(http://www.ncbi.nlm.nih,gov/projects/SNP)和基因组变异服务器数据库(http://gvs.gs.washington.edu/GVS147)进行检索,采用Haplo View 4.2 软件(Broad Institute,Cambridge,MA,USA)在中国北京汉族(CHB)和亚洲人群数据库中筛选NEDD4L基因中的标签SNP 位点。具体筛选标准为标签SNP位点的频率分布必须符合Hardy-Weinberg平衡定律(P≥0.05)、次要等位基因频率(minor allele frequency,MAF)P≥0.05,且连锁不平衡系数r2≥0.8。最终纳入了14个NEDD4L基因相关的SNP位点,分别为:rs9956206,rs557036,rs563283,rs4940647,rs4149601,rs6566939,rs4149605,rs73450471,rs482805,rs74408486,rs292449,rs2288774,rs2288775,rs7228980。
应用Gold Mag-Mini纯化试剂盒(Gold Mag有限公司,中国),提取所采集的受试者外周静脉血的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)。通过Mass ARRAY 检测平台对14 个NEDD4L 基因有关的SNP位点进行分型。基因分型实验均由北京博奥晶典生物技术有限公司负责。
1.6 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,其中,连续变量用均数±标准差()表示,分类变量用n/%表示,运用独立样本t检验进行两组之间均数的比较,运用方差分析进行多组间均数比较,再运用LSD-t检验进行组间两两比较。运用PLINK 软件(version 1.9)的精确检验法对先证者父母的基因型进行平衡检验和孟德尔一致性检验,并计算各个基因型的MAF值,通过构建不同遗传模型(加性模型、显性模型和隐性模型)后建立混合线性回归模型分析NEDD4L SNPs与人群血压钠钾反应性的关系。将年龄、性别和BMI作为固定效应,家系相关性作为随机效应在模型中进行校正。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 受试者的基线特征及血压的钠钾反应性
钠钾饮食干预时,受试者低盐期血压明显较基线期下降,高盐期血压则较基线期显著升高,此外,高盐补钾期血压显著低于高盐期(表1)。
表1 基线特征及饮食干预期的血压反应性Tab.1 Baseline characteristics and BP responses to dietary intervention
续表1
2.2 受试者各时期24 h尿液钠、钾的反应情况
基线期受试者的尿钠、尿钾排泄均呈现“高钠低钾”的现象,反映日常钠摄入过多而钾摄入不足,这一现象符合中国北方农村居住者的饮食习惯。与基线期相比,低盐期24 h尿钠排泄量显著降低,高盐期则显著升高;补钾24 h尿钾排泄量显著升高(表2),提示受试者对膳食干预依从性良好。
表2 受试者各时期24 h尿液钠、钾的排泄量Tab.2 Urinary excretions of sodium and potassium in the subjects during the intervention periods
2.3 NEDD4L基因SNP位点的基本信息
本研究纳入的SNP所在基因组位置、等位基因、MAF、Hardy-Weinberg检验结果显示,各SNP 位点基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(表3),表明受试者选自遗传平衡的大众人群,具有很强的代表性。
表3 NEDD4L基因各SNP位点的基本信息Tab.3 Characteristics of NEDD4L SNPs analyzed in this study
2.4 NEDD4L基因多态性与血压钠钾反应性的关联性
通过对所有位点与血压的钠钾反应性进行相关性分析发现,NEDD4L基因SNPs rs557036、rs563283、rs74408486、rs7228980与低盐期收缩压、舒张压或平均动脉压反应性显著相关(均P＜0.05);而SNPs rs292449、rs2288775与高盐期脉压差反应性显著相关;此外,rs9956206、rs563283、rs292449与高盐补钾期舒张压、平均动脉压或脉压差反应性显著相关(均P＜0.05,表4)。
表4 NEDD4L基因多态性与血压钠钾反应性的关联性Tab.4 Associations of NEDD4L gene polymorphisms with blood pressure response to sodium and potassium intake
续表4
基于本课题组建立的陕西“盐敏感性高血压研究队列”,本研究通过对受试者进行钠钾膳食干预,首次发现NEDD4L基因多个SNPs与血压钠钾反应性密切相关。其中NEDD4L基因SNPs rs74408486与低盐期收缩压、舒张压和平均动脉压反应性显著相关;而SNPs rs292449、rs2288775 与高盐期脉压差反应性显著相关。此外rs563283、rs292449 与高盐补钾期舒张压、平均动脉压及脉压差反应性显著相关。以上研究提示SNPs可能作为血压盐敏感性和钾敏感性的遗传标记点,此研究结果能够加深对高血压发生发展机制的理解,并为今后高血压的防治提供新的思路。
NEDD4家族属于HECT 类E3泛素连接酶,可识别不同的底物蛋白,参与多种心血管疾病的发生发展[8]。其中NEDD4L 主要参与血压的调节,通过其WW 结构域与ENaC亚基的PY 基序结合,使ENaC被泛素化及内吞,降低肾脏ENaC 的数量及活性,从而钠的重吸收减少、血压降低[10]。此外,NEDD4L还通过下调Na-Cl同向转运体(NCC)参与盐敏感高血压的发生[15]。NEDD4L基因由41个外显子组成,位于染色体18q21,其基因结构在人和小鼠体内均非常保守,并且有研究表明NEDD4L 基因参与原发性高血压、家族性直立性高血压的发生[12,16]。动物实验研究表明,大鼠NEDD4L的C2结构域与人类C2结构域100%相同,在正常口服盐摄入量下,野生幼崽和NEDD4L C2敲除小鼠均未表现出任何表型差异,而在高盐摄入量下,NEDD4L C2敲除小鼠的ENaC mRNA 表达逐步升高,尿钠排泄减少,血压升高,由此可见,NEDD4L C2敲除小鼠表现出盐敏感性高血压[17]。此外,基于人群的研究发现,rs4149601(G/A)和rs2288774(T/C)是人类NEDD4L 基因中常见的功能性单核苷酸多态性,并且这两种基因多态性与高血压有关,其主要表现为血压升高,肾素水平降低,盐敏感性随时间推移升高,NEDD4L rs4149601 G 等位基因的携带者的ENaC表达和肾脏钠重吸收较A 等位基因的携带者更高[18]。本研究通过对受试者进行慢性盐负荷干预,发现NEDD4L基因SNPs rs292449、rs2288775 与高盐期脉压差反应性显著相关,为NEDD4L 基因参与血压盐敏感性提供了新证据,加深了对血压盐敏感性遗传因素的理解。
目前研究显示血压与钠摄入呈正相关,与钾摄入呈负相关[4],大量的人群队列研究表明适量的膳食补钾可降低正常健康人群及高血压患者的血压水平,然而仍有证据显示补钾的降压作用存在种族差异性[19]。GENSALT[20]研究显示,在遗传背景相似的中国汉族人群中,补钾的血压变化受遗传因素的影响,表明人群存在血压的钾敏感性。KELLY 等[21]通过对906名汉族参与者参加了7 d的高钠饮食和7 d的高钠加钾饮食干预,发现染色体区域3q24-q26.1、3q28和11q22.3-q24.3与血压对钾反应的存在显着连锁信号,表明3号和11号染色体上的遗传区域可能具有重要的钾敏感性位点。本研究首次探讨了NEDD4L基因多态性与血压对于补钾后的反应性的关系,结果表明NEDD4LSNP rs9956206、rs563283、rs292449与高盐补钾期舒张压、平均动脉压或脉压差反应性显著相关,提示NEDD4L 基因可能参与血压钾敏感性的形成。目前动物研究表明,NEDD4L 通过调节多种钾通道蛋白参与机体的钾稳态,ZHANG等[22]研究显示肾小管NEDD4L缺陷小鼠中,肾脏髓外钾通道(the renal outer medullary potassium channel,ROMK)活性减低,并且在高钾饮食干预下仍不能刺激ROMK活性,可见NEDD4L 参与调节ROMK 活性。AL-QUSAIRI 等[23]发现肾小管SGK1缺失的小鼠中K+排泄减少,并且在高钾饮食时表现出严重的高钾血症,同时证实NEDD4L受SGK1的调节参与机体K+排泄。以上研究均表明NEDD4L 可能通过ROMK参与血压钾敏感性的调节。本研究结果为今后探索血压钾敏感性的发生机制提供新的思路,同时提示NEDD4L可能为高血压治疗的潜在靶点。
综上所述,本研究发现NEDD4L 基因多态性与血压钠钾反应性相关,这有助于综合环境及遗传因素,进一步明确血压钾敏感性的发生机制,为高血压的靶向治疗提供依据。鉴于本研究局限于中国北方人口,因此,膳食钠钾盐的摄入与NEDD4L基因多态性的关系可进一步在大型多种族人群队列中验证。
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