龙春莉，丘集维，陈珏莹，林强，谢永祥，史伟
1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；
2.南宁市中医医院，广西 南宁 530004；
3.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023
慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是指各种原因引起的肾脏损害或肾功能下降持续或超过3个月，严重者可发展至终末期肾脏病（ESKD）[1]。随着人口老龄化、慢性疾病的增长，CKD患病率也逐渐上升，成为全球重大的公共卫生问题。据统计，全球CKD患病率为9.1%，而我国CKD的患病率为10.8%，患者高达1.195亿人[2-3]。西医治疗CKD不能有效延缓肾功能进展，而中医药治疗具有多靶点、多通路、不良反应少的特点，在CKD治疗中有重要地位[4]。
水蛭始载于《神农本草经》，是水蛭科蚂蟥、水蛭或柳叶蚂蟥的干燥全体，具有破血通经、逐瘀消癥功效，常被应用于肾脏疾病的治疗中。水蛭以蛋白质及多肽类成分为主，水蛭素（hirudin）是水蛭提取物中的代表性成分，在心脑血管疾病、肾脏病、肿瘤等疾病中均被广泛使用[5]。
网络药理学的概念由Hopkins教授首次于2007年提出，并认为研发多种药物的设计方式可以提高临床疗效[6]。近年来，利用网络药理学探索中医药的研究逐年增多，其“网络靶标-系统调节”的模式特征与中药多成分、多靶点、多通路的特点具有相似性。本研究利用网络药理学方法，以水蛭中水蛭素为研究对象，整体分析水蛭素调控CKD的分子机制。
1.1 水蛭素结构及对应靶点筛选
在PubChem 数据库[7]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以“Hirudin”为检索词，检索水蛭素的SDF结构并下载。将水蛭素的SDF 结构文件导入SwissTargetPrediction数据库[8]（http://www.swisstargetprediction. ch/）， 设置物种为“Homo sapiens”，Probability＞0，预测化合物的潜在作用靶点。利用Cytoscape3.8.2软件构建水蛭素靶点网络图[9]。
1.2 慢性肾脏病靶点获取
以“Chronic Kidney Disease”为关键词，分别检索GeneCards数据库[10]（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库[11]（https://omim.org/）、DrugBank数据库[12]（https://go. drugbank. com/）、TTD数据库[13]（http://db. idrblab. net/ttd/） 中的疾病对应靶点。GeneCards数据库检索疾病靶点具有Score值，其数值越高提示该靶点与疾病关系越密切。若靶点过多，可根据Score值中位数情况筛选潜在靶点，合并4个数据库的潜在靶点后，删除重复靶点，获得疾病潜在靶点。通过仙桃学术（https://www.xiantao.love/products）在线工具进行韦恩图绘制，对水蛭素和CKD的对应靶点进行鉴定和交叉分析，以显示水蛭素与CKD靶点之间的相关性。
1.3 蛋白相互作用网络构建及核心靶点筛选
利用Cytoscape3.8.2软件的BisoGenet插件[14]构建蛋白相互作用（PPI）网络。将获取的水蛭素及CKD靶点分别导入BisoGenet中，合并二者网络图后提取交集靶点，即水蛭素治疗CKD的核心靶点。
1.4 核心靶点的器官定位
将以上获得的核心靶点导入BioGPS 数据库[15]（http://biogps.org/#goto=welcome）进行核心靶点的器官定位，观察核心靶点在肾脏的表达情况。
1.5 GO富集和KEGG通路富集分析
将筛选的核心靶点输入Metascape[16]（http://metascape.org）的靶基因名称列表，选择“Homo sapiens”作为GO富集和KEGG富集分析的物种。GO富集分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），将统计学意义阈值设为P＜0.01，并利用微生信在线（http://www.bioinformatics.com.cn/）、易汉博生物信息（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html）网站将分析结果可视化。
1.6 分子对接
结合核心靶点“Degree”值选取分子对接的靶点。利用RCSB PBD数据库（https://www1.rcsb.org/）下载蛋白的晶体结构，筛选条件：①选择生物体为“Homo sapiens”；
②优先选择口袋完整的结晶体；
③优先选择相似共晶体的晶体结构；
④选用X射线衍射法测定蛋白质的三维空间结构；
⑤优先选择分辨率高的晶体结构。将筛选后的蛋白通过PyMol 2.4.0软件进行去水、去除多余链，将水蛭素化合物结构转为3D结构并做能量最小化处理。将二者文件导入AutoDock Tools转换原子类型后寻找活性口袋，并利用AutoDock Vina进行分子对接。
2.1 水蛭素结构及对应靶点获取
在PubChem数据库获得水蛭素SDF结构，分子式为C287H440N80O113S7。在SwissTargetPrediction数据库将水蛭素SDF结构上传后获取相关靶点，设定Probability＞0，最终得到16个靶点，见图1。
图1 水蛭素及其对应靶点
2.2 慢性肾脏病相关靶点
从GeneCards 数据库获得疾病靶点14 552 个，Score最大值为203.05，最小值为0.18，根据中位数，设定Score＞23的目标靶点为潜在靶点，共获得919个潜在靶点。在OMIM、DrugBank、TTD数据库分别检索到CKD相关靶点200、27、24个，经合并、去重后，最终获得1 049个CKD相关靶点。将水蛭素的对应靶点与CKD靶点进行整合，发现有4个交集靶点，分别是HLA-A、AVPR2、REN、AGTR1，利用仙桃学术在线工具进行韦恩图绘制，见图2。
图2 水蛭素-CKD靶点韦恩图
2.3 蛋白相互作用网络构建与核心靶点
利用Cytoscape3.8.2软件的BisoGenet插件分别构建水蛭素与CKD的PPI网络，结果显示，与水蛭素潜在靶点产生直接或间接作用的靶点有773个，靶点之间相互关系13 819条。与CKD潜在靶点产生直接或间接作用的靶点有11 654个，靶点间相互关系231 354条，二者交集见图3。
图3 水蛭素治疗CKD交集靶点PPI网络
根据水蛭素治疗CKD的PPI网络和节点拓扑参数分析，以度中心性（DC）≥2倍中位数（即DC≥44）为筛选条件，获得靶点198个，靶点间相互关系5 798条。进一步以DC、接近中心性（CC）、中介中心性（BC）均大于等于其中位数（即DC≥74、CC≥0.579、BC≥58.745）为筛选条件，获得核心靶点73个，共有1 487条相互关系，结果见图4。将水蛭素治疗CKD的PPI网络数据导出，核心靶点中度值前6位的靶点是ITGA4（520）、FN1（391）、VCAM1（377）、NTRK1（356）、MCM2（313）、CUL3（282）。
图4 水蛭素治疗CKD核心靶点PPI网络
2.4 核心靶点器官定位结果
为了解核心靶点在肾脏的表达情况，将以上核心靶点导入BioGPS数据库，得到各个靶点在肾脏的表达情况。73个核心靶点共获得71个表达结果（2个靶点表达结果未检出）。以基因在肾脏表达大于其在其他组织器官表达的中位数为标准，发现有5个基因在肾脏的表达超过其在其他组织器官表达的中位数，分别为RPA3、CCDC8、ILF2、EGFR、VCAM1。整理核心靶点在肾脏的表达情况，发现在肾脏表达最大值为10 601.70（EEF1A1），最小值为2.40（HIST1H3E），以大于在肾脏表达的中位数为筛选条件，有36个核心靶点表达大于中位数，将结果导入Excel2016进行分析，见图5。
图5 水蛭素治疗CKD核心靶点在肾脏表达情况
2.5 核心靶点GO和KEGG富集分析
利用Metascape数据库对以上73个核心靶点进行GO 和KEGG 富集分析。将BP、CC、MF富集结果的LogP值升序排列，对前20位结果进行可视化（见图6）。BP主要涉及细胞质转录、肽生物合成过程、核糖蛋白复合物、DNA复制依赖性核小体等；
CC主要涉及游离核糖体、核酸蛋白复合物、核糖体亚基、黏着斑、蛋白-DNA复合物等；
MF涉及核糖体结构成分、细胞黏附分子结合、结构分子活性、rRNA结合等。共获得KEGG富集通路28条，前20位气泡图见图7，主要涉及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞周期信号通路、雌激素信号通路等。
图6 水蛭素治疗CKD核心靶点GO分析条图
图7 水蛭素治疗CKD核心靶点KEGG通路富集气泡图
2.6 分子对接验证
将核心靶点中度值前6位的靶点（ITGA4、FN1、VCAM1、NTRK1、MCM2、CUL3）与水蛭素进行分子对接。分子对接结果中结合能（affinity）数值越小，提示分子中的受体与配体结合构象越稳定。当affinity＜-7 kcal/mol时，表明二者具有较好的结合活性[17]。分子对接结果见表1，affinty＜-7 kcal/mol 的靶点有ITGA4、FN1、VCAM1、NTRK1、MCM2，其 中ITGA4靶点与水蛭素的affinity最小，说明相对于其他靶点，ITGA4与水蛭素的结合活性最好。
表1 水蛭素与核心靶点分子对接结果
CKD 属中医学“腰痛”“水肿”“肾风”“尿浊”“虚劳”“关格”“癃闭”等范畴。其本质为本虚标实，本虚为肾气不足，标实包括多种病理因素，如“湿”“瘀”“毒”等邪实。结合CKD迁延不愈的特征，可见其病程久而复杂，温病学派创始人叶天士认为，初病气结在经，久则血伤入络。诸多医家认为，瘀血贯穿疾病的全程[18]。水蛭常被用于治疗瘀血证。《本草汇言》有“逐恶血、瘀血之药也”；
《本草从新》有“治水肿、败毒”。金智生教授在临床实践中常用水蛭治疗肾脏病，认为水蛭具有“味咸专入血分，于气分毫无损害，而瘀血默消于无形”的功效[19]。莫宇凤等[20]探索治疗CKD的壮医药用药规律，其中包含水蛭的通两路（龙路、火路）药使用频次为43次，可见水蛭在治疗CKD中的重要地位。水蛭素作为水蛭的主要活性成分，药理学研究表明，其具有抗凝、抗血栓、抗纤维化、调节微血管再生、抗肿瘤、改善肾功能等作用[21]。
水蛭素被认为是作用最强的天然凝血酶特异性抑制剂，由65～66个氨基酸组成，分子量约7 000[22-23]，可显著抑制促炎信号通路，降低促炎因子白细胞介素-1b、白细胞介素-6、白细胞介素-8表达，通过降低肾组织转化生长因子-β1和纤维连接蛋白1表达及Ⅳ型胶原沉积抑制肾纤维化[24]。本研究经筛选后共获得水蛭素治疗CKD核心靶点73个。江欣等[25]通过同位素追踪法检测水蛭素在大耳兔中分布情况，实验结果表明，在实验中的每个时间点，水蛭素在肾脏的分布均高于其他组织，其次为血浆，证实水蛭素主要通过肾脏排泄，这从另一方面体现水蛭素治疗肾脏疾病的优势。根据度值大小来看，排名靠前的有ITGA4、FN1、VCAM1、NTRK1。整合素的表达及缺失与肾脏疾病存在相关性[26]，ITGA4作为整合素α链蛋白家族成员之一，在肾脏中也参与部分调节。有研究发现，抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎患者中抗髓过氧化物酶抗体通过α4-整合素诱导肾小球毛细血管内白细胞黏附[27]。FN1是分子量270 kD的糖蛋白，在肾小球压力增高时可引起足细胞对其表达上调，同时又与整合素及细胞外基质成分胶原、纤维蛋白等结合，共同起保护肾脏作用[28]。VCAM1能反映血管内损伤，并参与CKD 炎症反应，其水平高低影响CKD 的进展[29]。NTRK1不仅在大脑中表达，而且在肾脏和周围神经中表达，可能在NGF-TrkA信号作用下突变，导致该家族中的肾脏疾病[30]。由图5可见，EEF1A1、UBC是肾脏中表达较高的关键靶点。EEF1A1在衰老的肾小管细胞中表达下调，是肾小管上皮细胞衰老的生物标志物，还涉及细胞骨架重塑、蛋白质折叠和降解、细胞信号调节、细胞生长、细胞凋亡和细胞周期等[31]。UBC参与调节CKD中肌肉萎缩，通过激活半胱氨酸酶-3和泛素-蛋白酶体系统刺激肌肉中蛋白质降解[32]。
KEGG通路主要涉及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞周期信号通路、雌激素信号通路等。PI3K-Akt信号通路是CKD的重要信号通路之一，在低氧诱导下，肾小管间质纤维化和功能障碍加速CKD的进程[33]。PI3K是该通路的起始因子，而Akt是PI3K的下游靶点，抑制PI3K可以减少细胞外基质沉积，而抑制Akt 可导致梗阻性肾病的肌成纤维细胞标志物减少[34]。通过激活PI3K/Akt信号通路，降低有丝分裂活性而抑制氧化应激和炎症是治疗CKD的一种策略[35]。MAPK 信号通路在肾病中起重要作用，其关键因子（JNK和p38）与细胞凋亡和炎症有关。JNK信号通路能促进肾小管上皮细胞产生促炎和促纤维化分子，并促进肾小管细胞向间质表型分化[36]。转化生长因子-β1可激活p38MAPK信号通路，使炎症因子表达增多，加剧肾小球硬化及肾纤维化[37]。而水蛭素可通过p38MAPK/NF-κB途径抑制糖尿病肾病大鼠炎症反应，防止足细胞凋亡，对肾脏损伤有保护作用[38]。
综上所述，水蛭素治疗CKD可通过多靶点、多通路延缓疾病进展。然而本研究存在以下不足：①网络药理学研究依赖现有数据库中的数据资料，而数据的完整性及真实性会影响研究结果的误差，甚至出现假阳性或假阴性[39]；
②网络药理学研究依赖多种软件平台的运用，而每个软件的运算机制有所差异，如针对通路富集分析的平台有Metascape、 DAVID、Cytoscape 等，本研究未能针对每个平台进行分析；
③本研究未能对水蛭素相关靶点与通路做进一步的实验研究。后期将继续关注该领域的最新研究进展，对相关靶点和通路进行深入探究。