史聪翀，谢 涛，田婧君，杨 雁
外伤、龋损等可造成牙损伤继而引起牙髓坏死甚至牙松动脱落， 严重影响患者的面部美观和身心健康，甚至诱发医疗纠纷。据统计，中国约有5 亿人患有不同程度的牙缺失[1]，但有限的修复方式及诸多副作用难以满足临床需求， 因此如何有效实现或加快牙组织损伤修复成为亟待解决的问题。
牙本质既是保护牙髓的有力屏障，又具有再生修复的生理基础，因此诱导牙本质再生是重建完整牙结构的重要内容，也是实现全牙器官再生的突破口。
牙间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）定向分化为成牙本质细胞的过程，伴随一系列与增殖分化相关基因的时空表达及精密的程序性调控机制，是研究牙本质发育及修复再生的关键内容。
Wnt/β-catenin 信号通路是一条在不同物种间相似、在进化上相对保守的信号通路之一，目前认为Wnt 通路主要有3 种途径。
经典Wnt通路在牙发育的多个阶段发挥重要作用[2~4]。
前期研究证实Wnt/β-catenin 信号通路在调控成年小鼠切牙MSC[5，6]的增殖及分化中发挥非常重要的作用，但该通路对牙损伤后的修复作用却鲜有报道[7~10]。
故笔者研究旨在通过建立切牙损伤小鼠模型， 并通过Wnt/βcatenin 信号通路激活剂氯化锂（LiCl）及其抑制剂Dickkopf 相关蛋白1（Dickkopf 1，DKK1）干预小鼠切牙损伤模型[11，12]，采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法从大体形态学观察切牙损伤修复情况；
蛋白免疫印迹（Western blot）和定量反转录聚合酶链式反应 （quantificational reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测Wnt10a、人体内有AXIN2 编码的蛋白（Axis inhibition protein 2，Axin2）[13]、βcatenin 及牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）的表达；
在Wnt/β-catenin 信号通路激活与抑制状态下观察牙本质形成相关因子的变化，分析牙本质形成与Wnt/β-catenin 信号通路被激活或抑制之间是否存在相关性；
同时明确在Wnt 家族中Wnt10a 与牙损伤后牙本质修复密切相关；
通过小鼠切牙损伤实验初步研究Wnt/β-catenin 信号通路在牙损伤修复中的作用，为临床应用及优化牙再生策略等组织工程技术领域的发展提供更多的动物体内实验数据。
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
选择雌性昆明小鼠40 只，鼠龄6 ～8 周，体质量18 ～22 g。由昆明医科大学实验动物学部提供，动物使用许可证号SYXK（滇）K2015-0002。按照常规方法饲养。
1.1.2 主要试剂及器材
DKK1 重组蛋白（H00022943-P01）（台湾Abnova，中国）；
LiCl（C8381）和HE 染色试剂盒（北京Solaibio，中国）；
Wnt10a、Axin2、β-catenin 和DSPP 抗体（Millipore，美国）；
Wnt10a、Axin2、β-catenin 和DSPP引物 （擎科生物公司， 中国）；
qRT-PCR 试剂盒（Genecopoeia，美国）。
磨牙手柄（苏州美鹦电子科技有限公司，中国）；
荧光显微镜（Zeiss，德国）；
荧光定量PCR 仪（Thermo Fisher，美国）。
1.2 方法
1.2.1 实验分组与切牙损伤小鼠模型建立
实验采用完全随机法分为Control 组、Model 组、LiCl 组（Wnt/β-catenin 信号通路激活组）和DKK1 组（Wnt/β-catenin 信号通路抑制组）4 组， 每组10 只。Control 组：无切牙损伤。
除Control 组外，其余组使用临床慢速机头在小鼠右侧切牙制备缺损，同时使用无菌0.9%氯化钠溶液（生理盐水）冷却，钻至肉眼观察到明显的红色穿髓点，缺损直径为1.0 ～1.5 mm，深度为0.5 ～1.0 mm。
1.2.2 治疗方法
Control 组：不使用药物。Model 组：在切牙损伤侧、牙周膜局部注射0.9%氯化钠溶液（生理盐水）。LiCl 组：在切牙损伤侧、牙周膜局部注射LiCl（0.75 g/L），剂量0.2 mL/kg，1 次/2 天。DKK1 组：在切牙损伤侧、牙周膜局部注射DKK1 蛋白，剂量0.2 μg/kg，1 次/2 天。
每天观察并记录小鼠切牙愈合情况，于切牙损伤后第7 天脱颈处死所有小鼠。
另外5 只小鼠取损伤切牙侧牙髓进行Western blot 和qRT-PCR 检测， 检测步骤如下所述。
1.2.3 病理检查
每组分别取5 只处死小鼠， 取损伤侧完整切牙；
去除附着在上面的软组织，将其置于4%多聚甲醛溶液中4 ℃条件下过夜，于10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA)（pH 7.4）中脱钙处理4周，石蜡包埋制成切片，行HE 染色。观察成牙本质细胞及修复性牙本质的形成情况。
1.2.4 定量反转录聚合酶链式反应检测
通 过qRT-PCR 分 别 检 测Wnt10a、β-catenin、Axin2 及DSPP 的mRNA 水平变化。具体方法如下：每组分别取5 只处死小鼠。每组分别取1 份损伤侧新鲜牙髓组织采用Trizol 法提取总RNA，然后进行逆转录反应，再用2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒进行qPCR 反应， 反应程序为：95 ℃预变性1 min；
95 ℃变性20 s，55℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环；
72 ℃延伸5 min；
4 ℃条件下保存。
相关引物序列如下：Wnt10a，正向5"-GGCAGATGGAGGTGTGTGTG-3"，反向5"-AGGAAGTATGGCCGGGTGTT-3"；
β-catenin，正向5"-CCTTCACAACCTTTCTCACCAC-3"，反向5"-ACAGACAGCACTTTCAGCACTC-3"；
Axin2，正向5"-TGGACTTCTGGTTTGCTTGTAA-3"， 反向5"-TCTCGTATGTAGGTCTTGGTGG-3"；
DSPP，正向5"-CTCTGTGGCTGTGCCTCTTCTA-3"，反向5"-CAGTGTTCCCCTGTTCGTTTAC-3"；
GAPDH，正向5"-CTTTGGCATTG TGGAAGGGCTC-3"，反向5"-GCAGGGATGATGTTCTGGGCAG-3"。
1.2.5 Western blot 检测
按Western blot 常规操作检测Wnt10a、β-catenin、Axin2 及DSPP 蛋白水平，相关抗体均按照1 ∶1 000稀释。
具体方法如：取一份牙髓组织经过提取总蛋白→蛋白浓度测定和变性→SDS-PAGE 电泳→转膜→封闭→孵育抗体→显影。
1.3 统计学方法
应用SPSS 13.0 软件进行分析。
所有的数值均采用均数± 标准差表示，多个样本比较时，用单因素方差分析（One-Way ANOVA），用Dunnet-t 检验进行两两比较处理。
P ＜0.05 为差异有统计学意义。
采用GraphPad Prism 8.0 软件制作柱状图。
2.1 4 组小鼠牙本质-牙髓损伤后的恢复情况比较
用磨牙钻头在小鼠切牙模拟穿髓后可见明显缺损（图1A）。
损伤后第4 天各组均有切牙恢复的小鼠出现，损伤后第6 天LiCl 组10 只小鼠切牙缺损全部恢复， 第7 天Model 组10 只小鼠均未观察到切牙缺损；
但DKK1 组至损伤后第7 天只有3 只小鼠切牙恢复， 与Model 组对比，LiCl 组恢复速度显著加快，DKK1 组则明显减慢（图1B）。
图1 小鼠切牙恢复情况大体病理图和恢复曲线Fig.1 Diagrams of gross pathological and restoration curve of incisor in mice
2.2 4 组大鼠牙损伤病理组织比较
HE 染色结果显示，与Control 组（图2A1）比较，LiCl 组牙釉质和牙本质均得到良好修复 （图2C1）；
Model 组次之，损伤处牙釉质仍有小面积空白区（图2B1）；
DKK1 组损伤处牙釉质有大面积的空白区，几乎未修复（图2D1）。
Control 组成牙本质细胞、牙髓细胞排列整齐（图2A2），LiCl 组成牙本质细胞与牙髓细胞交界处细胞数量增加，图片显示呈一条深染的蓝线（图2C2），Model 组也有此现象（图2B2），但不及LiCl组明显，Control 组和DKK1 组则无此现象（图2D2）。
图2 4 组切牙损伤HE 染色对比Fig.2 Comparison of HE staining of incisor injury in 4 groups
2.3 4 组Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP mRNA 表达比较
RT-PCR 结果表示，Control 组与Model 组相比，Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP mRNA 表达水平均下降，且β-catenin 和Axin2 下降显著（P<0.05）；
LiCl组与Model 组相比，Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP表达水均上升，而DKK1 组均下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。
见表1。
表1 4 组Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP mRNA 表达水平比较Tab.1 Comparison of mRNA expression levels of Wnt10a,β-catenin,Axin2 and DSPP in 4 groups
2.4 4 组Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表达比较
Western blot 结果显示，与Control 组相比，Model组Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义（P<0.05）；
与Model 组相比，Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表达水平在LiCl 组上升，在DKK1 组下降，差异均有统计学 意义（P<0.05）。
见表2、图3。
表2 4 组Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表达水平比较Tab.2 Comparison of protein expression levels of Wnt10a,β-catenin,Axin2 and DSPP in 4 groups
图3 4 组Wnt10a、β-catenin、Axin2 和DSPP 蛋白表达水平电泳图Fig.3 Electrophoretogram of Wnt10a, β-catenin, Axin2 and DSPP protein expression levels in 4 groups
牙损伤是人类常见的疾病，可引发多种不良并发症，不仅影响人们发音、咬合、咀嚼等功能，还可因美观问题带来一系列的心理问题；
但目前临床有限的修复方式越来越难以满足患者的期望值，因此牙损伤后如何快速有效的修复一直深受科学研究领域的重视。笔者研究利用小鼠切牙损伤模型作为研究对象，通过Wnt/β-catenin 途径的LiCl 活化或DKK1 抑制，研究该通路在牙损伤修复过程中的作用。
小鼠切牙在一生中不断生长，这种持续的生长包括了由上皮干细胞产生的成釉细胞和由MSC 分化而来的牙本质细胞和牙髓细胞的持续更新，位于切牙近端区域的MSC， 首先形成增殖活跃的转运扩增细胞（transit amplifying cells，TAC）， 再分化形成牙髓细胞和成牙本质细胞， 牙本质由成牙本质细胞矿化而成，以保持终身和持续的切牙生长。这为研究牙损伤修复提供了极佳的模型[14~18]。
有实验研究发现，小鼠切牙MSC 增殖分化的周期大约为1 个月， 笔者实验的前期研究[19]利用谱系追踪也证实了这一点，结合实验中具体观察到的结果，将实验周期设定为1 周，旨在研究牙损伤修复过程中Wnt/β-catenin 通路是否为重要的影响因素。DSPP 是牙本质形成的特异性标记蛋白[20]。β-catenin、Axin2 是存在于多种细胞中Wnt/β-catenin通路的重要调节因子，能在胚胎发育过程中阶段性特异性地表达[21~23]。
该通路的重要成员Wnt10a 也在牙发育中发挥重要作用，Wnt10a 与根分叉的形成密切相关[24]，Wnt10a 基因突变可引起先天性缺牙[10]。
此外，Wnt10a 在分泌性成牙本质细胞中被检测到， 且能与成牙本质细胞的DSPP 共聚集[25]。
所以笔者实验的qRT-PCR及Western blot 选择这几个重要因子作为检测Wnt/β-catenin 通路变化及牙本质形成的指标。
笔者实验发现， 切牙损伤后第7 天，4 组的修复情况出现较大差异，LiCl 组修复情况最为理想，DKK1组几乎未修复， 提示Wnt/β-catenin 通路在切牙损伤后的修复过程中发挥重要作用，激活该通路可加快局部修复过程， 反之则出现抑制。
HE 染色显示，在Model 组和LiCl 组中，成牙本质细胞与牙髓细胞交界处出现染色加深、 细胞数量增加的现象，LiCl 组更为明显，推测与损伤后MSC 增殖分化加快修复有关，激活Wnt/β-catenin 通路可加速小鼠牙本质-牙髓损伤修复过程，反之则减慢。
Western blot 和qRT-PCR 检测Wnt/β-catenin 通路相关因子表达结果均显示，Li-Cl 干预可以显著提高Axin2 及β-catenin mRNA 水平和蛋白水平表达， 且远高于DKK1 组及Model 组。DKK1 干预可以显著降低Axin2 及β-catenin mRNA水平和蛋白水平表达，且远低于Model 组。
结果提示LiCl 干预可以明显激活Axin2 和β-catenin， 同样在DKK1 干预的情况下可以明显抑制Axin2 和βcatenin， 说明牙周膜局部注射LiCl、DKK1 是明确可以影响切牙中Wnt/β-catenin 以影响切牙中信号通路的激活或者抑制。在LiCl 组，Wnt10a 及DSPP 的表达明显高于Control 组，DKK1 组则相反， 提示Wnt/βcatenin 通路对切牙损伤后的修复和调控DSPP 的表达相关。
同时在笔者实验中，对多个Wnt 家族成员进行检验，证实Wnt10a 在牙损伤修复的过程中变化最为明显，且与DSPP 的变化高度一致，提示Wnt10a 可能是DSPP 的上游调节蛋白，调控DSPP 的表达，这与Yamashiro T 等[25]体外实验研究结果一致。
然而，对于Wnt10a 如何调控DSPP 的表达， 继而影响牙损伤后修复的过程，是否存在和其他信号通路的协同作用尚需进一步的实验研究。
综上，笔者实验成功构建了切牙牙本质-牙髓损伤小鼠模型， 通过牙周膜局部注射0.2 mL/kg 剂量的LiCl 溶液 （0.75 g/L） 或注射0.2 μg/kg 剂量的DKK1蛋白可成功激活或抑制牙本质-牙髓损伤小鼠模型的Wnt/β-catenin 信号通路。
通过多种实验方法 （RTPCR、Western blot、HE 染 色 等）， 检 测Wnt10a、βcatenin、Axin2 和DSPP mRNA 及蛋白水平表达结果发现，Wnt/β-catenin 信号通路在切牙损伤后的修复过程中确实发挥重要作用，激活该通路能加快局部修复过程，反之则会抑制修复过程；
同时Wnt10a 明显参与了这一过程，作为DSPP 的上游调节因子，其可能通过Wnt/β-catenin 通路激活后促进DSPP 蛋白的表达， 进而促进修复性牙本质的形成及成熟和钙化，但其深入的分子机制需进一步设计相关的实验进行研究。
笔者研究丰富了对Wnt/β-catenin 通路的相关研究，为后续实验奠定了基础，也为临床牙损伤修复治疗的研究提供了新线索。
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