万家颖，王银
作者单位武汉市第一医院（武汉市中西医结合医院）a.肾病内科，b.检验科 武汉430022
胶质母细胞瘤是复发率、转移率和致死率极高的疾病[1]。经过治疗患者的生存期大多仍然只有14 个月，5 年总体生存率不足5%[2]。因此，早期精准诊断及评估肿瘤的侵袭性对提高患者生存率具有重要的临床意义。褪黑素（melatonin，MT）是由脑松果体分泌的激素之一，化学名为N-乙酰基-5甲氧基色胺（Methoxytryptamine，MT）。MT 是一种胶质母细胞瘤靶向药物，能够有效的抑制胶质母细胞瘤细胞的侵袭和转移[3]，临床实验也证实了MT可以改善胶质母细胞瘤患者的生存率[4]。因此，本研究选择MT作为胶质母细胞瘤的靶向配体，将其与近红外染料Cy5偶联制备胶质母细胞瘤成像探针，并在细胞水平评价探针对胶质母细胞瘤的靶向性以及成像效果，以期为胶质母细胞瘤的精准成像提供参考探针。
1.1 主要试剂与材料
1.1.2 主要试剂和仪器 5-MT 和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购于北京伊诺凯科技有限公司；
DMEM培养基购于上海帝博思生物科技有限公司；
胎牛血清购于美国Gibco公司；
人神经胶质瘤细胞（U87）和人脑星型胶质细胞（HEB）分别购于国家生物医学实验室细胞资源库以及湖南丰晖生物科技有限公司；
MTT 试剂盒购于Sigma 公司。ELx800型酶标仪购于Biotek公司；
BSA124S型电子分析天平购于赛多利斯公司；
C6型流式细胞仪购于BD 公司；
激光共聚焦显微镜购于蔡司公司。
1.2 方法
1.2.1 探针合成 将5-MT（3.8 mg，20 μM）和Cy5-NHS（11.6 mg，20 μM）溶解到2 mLDMSO中，室温搅拌5 min后，加入三乙胺（6.1 mg，60 μM），在室温下继续反应12 h，然后将反应液进行冷冻干燥，粗产物用高效液相色谱进行分离（流动相：85%甲醇/15%水，V/V），得到绿色的粉末（12.1 mg，92.8%），见图1。
图1 探针Cy5-MT的合成路线
1.2.2 体外细胞毒性实验 取对数生长期的U87细胞以及HEB 细胞，胰酶消化后接种到96 孔板中，细胞密度约为1×104个/孔，每孔加入DMEM 100 μL，空白对照不加入细胞。将96 孔板置于5%CO2和37℃的培养箱中孵育12 h，弃去培养基，每孔分别加入200µL浓度为0、0.5、1、10、20、50、100 和200 μmol/L 的探针，空白对照组只加入200µL的培养基。随后，将96孔板在细胞培养箱中分别继续孵育24 h和48 h，弃去培养液，每孔加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液和100 μL 培养基，继续孵育4 h，弃去培养液，再在每孔加入150 μL 的DMSO，在摇床上震荡15 min，使结晶物充分的溶解。使用酶标仪在波长为490 nm处测定每孔吸光度（OD）值，计算细胞在不同浓度探针孵育下的存活率：
1.2.3 流式细胞实验 取对数生长期的U87 和HEB 细胞，胰酶消化后接种到6 孔板中，细胞密度约5×105个/孔，在培养箱中孵育12 h 后加入浓度为0、0.25、0.50、1.00、5.00 μM 的探针Cy5-MT 或Cy5 孵育3 h，随后将细胞用PBS洗涤3次，用胰酶消化后离心收集细胞，用BD 流式细胞仪进行测试，分析U87 细胞和HEB细胞对Cy5-MT探针的百分摄取率。
1.2.4 激光共聚焦成像实验 取对数生长期的U87细胞，胰酶消化后接种到小皿中，细胞密度约为500个/皿。将细胞在培养箱中孵育12 h 后加入0.25 μM Cy5-MT或0.25 μM Cy5孵育3 h，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定细胞，PBS 洗涤3 次，0.2%Triton-100 破膜20 min，PBS洗涤3次，3%BSA封闭1 h，PBS 洗涤3 次，5 g/mL的DAPI 染核3 min，PBS 洗涤3 次，加入防淬灭剂。Zeiss710激光共聚焦显微镜进行观察。
1.3 统计学处理
2.1 探针体外细胞毒性
MTT 实验结果显示，当U87 和HEB 细胞与探针Cy5-MT 孵育24 h 和48 h 后，存活率均较高。即使在Cy5-MT 浓度为100 和200 μmol/L 的处理下，2 种细胞的存活率仍可达到80%以上，见表1。
表1 U87和HEB细胞与Cy5-MT探针孵育的存活率（±s）
表1 U87和HEB细胞与Cy5-MT探针孵育的存活率（±s）
探针浓度/(μmol/L)200 100 50 20细胞存活率/%50 24 h U87 84.6±1.9 88.8±6.9 95.5±0.7 92.2±6.7 91.2±4.3 100.0±7.9 HEB 87.0±1.3 89.7±2.7 95.4±4.0 95.6±2.5 96.4±3.6 100.0±2.3 48 h U87 84.2±5.1 93.8±8.2 91.9±2.1 91.6±4.0 95.4±7.5 100.0±0.6 HEB 85.2±1.9 88.5±5.3 94.7±8.6 92.0±7.2 97.3±5.2 100.0±7.9
2.2 肿瘤细胞对探针的摄取率
流式细胞检测结果显示，U87细胞对Cy5-MT探针的摄取百分率显著高于Cy5（均P＜0.05），且U87细胞对Cy5-MT 探针的摄取百分率随着探针Cy5-MT 浓度的增加而增加；
当Cy5-MT 的浓度为5 μmol/L 时，U87细胞对Cy5-MT 摄取率为99.9%。HEB 细胞对探针Cy5-MT 和Cy5 的摄取百分率低于U87 细胞（均P＜0.05），当探针浓度为5 μmol/L和2.5 μmol/L时，HEB对Cy5-MT的摄取百分率高于Cy5，见表2。
表2 U87和HEB细胞对探针Cy5-MT和染料Cy5的摄取百分率（±s）
表2 U87和HEB细胞对探针Cy5-MT和染料Cy5的摄取百分率（±s）
注：与同一组细胞Cy5比较，①P＜0.05；
与U87细胞对相同浓度Cy5-MT的摄取百分率比较，②P＜0.05
探针浓度/(μmol/L)5.00 2.50 1.00 0.50 0.25 0相对百分摄取率/%U87 Cy5-MT 99.9±0.0①98.5±0.3①43.8±1.7①24.8±0.7①4.4±0.1①0.3±0.1 HEB Cy5-MT 59.9±8.1①②15.6±0.6①②2.7±1.1②0.9±0.6②0.5±0.4②0.1±0.1 Cy5 13.6±0.7 3.6±0.3 0.7±0.1 0.8±0.1 0.4±0.1 0.2±0.0 Cy5 49.7±0.1 2.8±0.6 0.9±0.3 0.5±0.2 0.4±0.1 0.3±0.1
2.3 探针体外细胞成像
与Cy5-MT 共同孵育后，U87 细胞对探针Cy5-MT（绿色荧光）有着明显的摄取，实现了对肿瘤细胞成像；
与Cy5 共同孵育后，U87 细胞对探针Cy5 的摄取显著地减少，几乎没有摄取，见图2。
图2 探针Cy5-MT及Cy5对胶质母细胞瘤U87的成像效果
分子影像技术是在传统影像学基础上发展的新型成像技术，能够在疾病早期在分子水平和细胞水平观察体内的生物过程，能够实时无创的监测疾病的发展[5]。这种技术通过借助分子探针和成像设备能够将肉眼不可见的病灶进行点亮，使得疾病组织能够被精准的检测，在术中病灶能够被精准的切除。若在疾病的早期阶段采用有效的分子影像技术提高疾病的诊断效率，将会显著的提高患者的存活率，该技术尤其是在肿瘤早诊的方面具有独特的优势。分子影像技术的关键是开发出肿瘤高特异性、高灵敏的靶向探针，能够精准的对肿瘤进行成像[6]。目前已有数个探针被开发在临床上用于肿瘤的精准成像和手术导航。2011年van Dam等[7]开发了一种靶向叶酸α受体的近红外探针实现了对卵巢癌患者癌变组织的精准切除；
2020年Hu等[8]采用荧光染料吲哚青绿（ICG）对肝癌患者的微小病灶和部分转移灶组织实现了精准的切除。
针对胶质母细胞瘤的精准诊断，目前也有多个靶向探针被报道。例如，2018 年有学者[9]以尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）为靶标，将uPAR 的靶向配体多肽AE105与近红外二区染料CH1055偶联制得了探针CH1055-4Glu-AE105。该探针不仅能够精准的对胶质母细胞瘤进行成像，还能对胶质母细胞瘤的术中切除提供指导。2019 年有学者[10]以整合素αvβ3 为靶点，将其配体多肽RWrNK与荧光染料Cy5制得了探针Cy5-RWrNK。在胶质母细胞瘤的动物模型上，探针Cy5-RWrNK 也准确地可视化了肿瘤组织。这些探针的研发有助于胶质母细胞瘤的诊疗。但目前能在临床用于胶质母细胞瘤诊疗的探针却很少，因为已报道的大部分探针存在生物相容性差、肿瘤成像对比度低等缺点。因此，临床上亟需胶质母细胞瘤的成像探针。
研究发现MT是对胶质母细胞瘤具有高亲和力的靶向配体[11]，本研究将其用荧光染料Cy5 进行标记，构建出胶质母细胞瘤的成像探针Cy5-MT，并通过质谱确证结构。在细胞毒性实验中发现，即使探针在200 μmol/L 的高浓度，对U87 和HEB 细胞的抑制率仍然低，提示探针Cy5-MT的毒性小，具有高的生物安全性。在流式细胞实验中发现，探针Cy5-MT 在肿瘤细胞U87 中的摄取率比正常细胞HEB 高，表明探针Cy5-MT 能够选择性的靶向胶质母细胞瘤细胞U87。在激光共聚焦实验中，探针Cy5-MT 能够特异性对胶质母细胞瘤细胞U87 进行精准成像。综上所述，本研究对胶质母细胞瘤的成像探针进行了探索，为该疾病的精准诊断提供了一定的参考意义。
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