何思悦，唐紫云，刘 衡，张成桂，周 雯，毕子莹，周 玥*
（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；
2.大理大学药学院，云南大理 671000）
慢性髓细胞性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是一种恶性骨髓增生性肿瘤，占成人白血病发病率的15%。目前酪氨酸激酶抑制剂是靶向治疗的主要方式，但治疗过程中易出现多种不良反应和副作用，对患者的治疗和生活造成极大的影响〔1〕。近年来，中药在白血病治疗方面的作用得到广泛关注，中药在抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、联合放化疗、逆转多药耐药等方面效果显著〔2〕。美洲大蠊Periplaneta americana L.隶属蜚蠊科，古时多用于创伤修复、祛腐生肌、清热解毒等，现研究发现美洲大蠊具有增强免疫力、抗病毒等多种药理活性，对多种肿瘤细胞有不同程度的抑制作用，而且原材料丰富，容易获取，应用前景广泛。有研究〔3-4〕表明，通过不同提取方法得到的多种美洲大蠊提取物对K562 细胞的增殖有不同程度的抑制作用，但具体机制尚不清楚。美洲大蠊提取物CⅡ-3 是提取于美洲大蠊的一种小分子肽〔5〕，主要通过抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管的生成及转移、免疫调节、逆转多药耐药等方面发挥其抗癌作用〔6〕。本研究探究美洲大蠊提取物CⅡ-3 对人白血病细胞K562 增殖的影响，为开发低毒有效的抗肿瘤药物提供实验基础。
1.1 材料美洲大蠊提取物CⅡ-3 由大理大学药学院张成桂教授提供；
K562 细胞（齐式生物科技有限公司）；
RPMI1640 培养基（美仑生物公司，批号：C0039）；
胎牛血清（Vivacell 公司，批号：2025067）；
磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（北京索莱宝科技公司，批号：P1003）；
细胞周期检测试剂盒（KeyGEN BioTECH 公司，批号：KGA512）；
磷酸化p53 抗体（Abcam 公司，批号：ab32132）；
羊抗兔抗体（Sigma 公司，批号：40839）；
ECL 增强化学发光检测试剂盒（PIERCE 公司，批号：32209）。
1.2 仪器多功能酶标仪（BIO-RAD 公司）；
高压蒸气灭菌器（Sanyo 公司）；
生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；
二氧化碳培养箱（Sanyo 公司）；
低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；
倒置显微镜（Motic 公司）；
细胞计数板（上海医用仪器厂）；
流式细胞仪（Beckman 公司）；
垂直板电泳转移装置（BIO-RAD 公司）；
图像分析系统（LabworksTM Analysis Software 公司）。
2.1 细胞培养 用RPMI1640 培养基（含10% 胎牛血清）于37 ℃、5%CO2培养箱中培养K562 细胞，培养2～3 d 计数并传代，取对数生长期细胞进行后续实验。
2.2 CCK-8 法检测细胞增殖活性取对数生长期的K562 细胞，以1×105个/mL 的密度将细胞接种于96 孔板内，每孔100 μL，实验组分别加入终浓度为5、10、20、40、80、160 μg/mL 的CⅡ-3，每孔50 μL，每个浓度设置3 个复孔，并设空白对照组（仅有K562 细胞，不加CⅡ-3，以下简称“对照组”），置于37 ℃、5% CO2培养箱内分别培养24、48、72 h，加入10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度（OD）值，并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=［（对照组OD 值-实验组OD值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）］×100%，其中，空白组仅有培养基，用于消除计算时培养基内酚红对OD 值的影响。
2.3 细胞集落形成实验 收集对照组细胞和经80 μg/mL CⅡ-3 处理72 h 的细胞并计数，以1×103个/mL的密度接种于24 孔板内，每孔500 μL，每组设置3个复孔，于培养箱内孵育7 d，倒置显微镜下观察并计数细胞集落数，以细胞数＞50 为1 个集落，计算细胞集落形成率和细胞集落抑制率。细胞集落形成率（%）=（细胞平均集落数/每孔加入的细胞数）×100%；
细胞集落抑制率（%）=［（对照组细胞集落数-实验组细胞集落数）/对照组细胞集落数］×100%。
2.4 流式细胞术分析细胞周期收集对照组细胞和经80 μg/mL CⅡ-3 处理72 h 的细胞，预冷PBS洗涤，加入1 mL 75%乙醇吹打混匀，4 ℃固定过夜。1 000 r/min 离心后收集细胞，PBS 洗涤，加入碘化丙啶染色液，37 ℃避光温浴30 min，流式细胞仪测定488 nm 波长处荧光强度。
2.5 蛋白质印迹法检测磷酸化p53 蛋白表达 收集对照组细胞和经80 μg/mL CⅡ-3 处理72 h 的细胞，PBS 洗涤，加入蛋白裂解液提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，取20 μg 蛋白进行上样。经电泳分离后转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗磷酸化p53（1∶500 稀释），4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗涤条带3 次，加入二抗（1∶1 000 稀释）孵育1.5 h，ECL 曝光液显色后凝胶成像系统采集图像，测定蛋白条带灰度值，计算蛋白相对表达量。
2.6 统计分析采用SPSS 26.0 软件进行统计分析，计量资料以（）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。
3.1 CⅡ-3 对K562 细胞增殖的影响CCK-8 法检测结果显示：24、48、72 h 时，不同浓度的CⅡ-3对K562 细胞的增殖均有抑制作用，随着作用时间延长，大多数浓度CⅡ-3 对K562 细胞增殖抑制作用增强，因此，选择72 h 作为培养时间。在作用时间为72 h 时，CⅡ-3 浓度为80 μg/mL，细胞增殖抑制率最高，与大多数作用浓度和作用时间相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。因此，选择80 μg/mL CⅡ-3 作用72 h 进行后续实验。
表1 CⅡ-3 对K562 细胞增殖的抑制率（%，，n=3）
表1 CⅡ-3 对K562 细胞增殖的抑制率（%，，n=3）
注：在作用时间相同的情况下，与80 μg/mL CⅡ-3 比较*P＜0.05；
CⅡ-3 浓度为80 μg/mL 时，与作用72 h 比较△P＜0.05。
3.2 CⅡ-3 对K562 细胞集落形成能力的影响与对照组相比，80 μg/mL CⅡ-3 作用于K562 细胞72 h 后，实验组细胞集落数明显减少，细胞集落形成率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2、图1。
图1 CⅡ-3 对K562 细胞集落形成能力的影响（×100）
表2 CⅡ-3 对K562 细胞集落形成能力的影响（，n=3）
表2 CⅡ-3 对K562 细胞集落形成能力的影响（，n=3）
注：与对照组相比**P＜0.01。
3.3 CⅡ-3 对K562 细胞周期的影响流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，80 μg/mL CⅡ-3 作用于K562 细胞72 h 后，G0/G1 期细胞比例明显升高，S 期细胞比例显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3、图2。
图2 CⅡ-3 对K562 细胞周期的影响
表3 CⅡ-3 对K562 细胞周期的影响（%，，n=3）
表3 CⅡ-3 对K562 细胞周期的影响（%，，n=3）
注：与对照组相比**P＜0.01。
3.4 CⅡ-3 对K562 细胞磷酸化p53 蛋白表达的影响蛋白质印迹法结果显示，与对照组相比，80 μg/mL CⅡ-3 作用72 h 后，磷酸化p53 蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。
图3 CⅡ-3 对K562 细胞磷酸化p53 蛋白表达的影响
CML 是一种起源于造血干细胞的骨髓增生性疾病，化疗是目前临床上主要治疗方案，但化疗所导致的副作用极大地影响患者的治疗效果和生活质量〔7〕。因此，寻找高效、低毒副作用的药物成为治疗的新目标〔8〕。
高三尖杉酯碱是从我国特有植物粗榧中提取的一种生物碱，研究〔9〕表明其具有抗肿瘤活性，对K562 细胞有抑制增殖、诱导凋亡、阻滞细胞周期等作用，在临床治疗中，广泛用于治疗急性髓系白血病、慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合征，2012 年被美国食品药品监督管理局批准用于治疗伊马替尼耐药的CML 患者，由此可见中药在白血病治疗方面有着很大的潜力。美洲大蠊，古时称蜚蠊，其药用价值最早在《神农本草经》中记载，具有活血散瘀的功效〔10〕。有研究〔11〕结果表明，美洲大蠊在抗肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌等方面疗效显著，有着良好的应用前景。
研究〔3〕表明，美洲大蠊提取物对K562 细胞、人原髓细胞白血病HL-60 细胞和小鼠淋巴样瘤P388D1 细胞的生长均有抑制作用。本研究中，CCK-8法测定结果显示，美洲大蠊提取物CⅡ-3 浓度为80 μg/mL、作用72 h 时，对K562 细胞增殖抑制率最高，为（57.8±1.0）%，故选择此浓度及作用时间进行后续实验。集落形成实验可以直观地反映肿瘤细胞的群体依赖性和增殖能力〔12〕，经80 μg/mL CⅡ-3作用72 h 的K562 细胞其集落形成能力明显下降，以上结果说明CⅡ-3 能够抑制K562 细胞增殖。
细胞增殖依赖于正常的细胞周期进程，包括G0/G1 期、S 期、G2 期、M 期4 个时期，癌细胞的细胞周期调节失调，细胞无限增殖分裂〔13〕，这种异常的细胞周期进程是导致肿瘤发生的基本机制之一〔14〕。处于G0/G1 期的细胞被称为静止期或非增殖状态，将肿瘤细胞阻滞在该周期，就能达到抑制肿瘤细胞增殖的目的〔15〕。本研究中，流式细胞术结果显示，与对照组相比，实验组阻滞在G0/G1 期的K562细胞显著增加，S 期的细胞明显减少，由此可知CⅡ-3通过阻滞肿瘤细胞周期，从而抑制K562 细胞增殖。
p53 蛋白可以使细胞周期阻滞在G1 期，还可以间接抑制细胞周期依赖激酶的活性，进一步抑制细胞增殖〔16〕。有研究〔17〕表明，姜黄素衍生物能够通过上调p53 蛋白表达水平导致细胞周期阻滞，抑制细胞增殖。p53 蛋白的磷酸化与癌症关系密切，p53蛋白的磷酸化水平增加可以抑制肿瘤的形成〔18〕。p53 蛋白的磷酸化修饰是稳定和增强p53 蛋白转录活性的关键〔19〕，因此，本研究中检测了磷酸化p53蛋白的表达，与对照组相比，CⅡ-3 诱导后的K562细胞磷酸化p53 蛋白表达水平升高，提示CⅡ-3 通过调控p53 蛋白抑制K562 细胞增殖。
本研究探讨了美洲大蠊提取物CⅡ-3 对K562细胞增殖的影响，结果表明，CⅡ-3 可以抑制K562细胞的增殖，降低细胞集落形成率，使阻滞在G0/G1期的细胞比例增加，S 期的细胞比例减少，并上调p53 蛋白的表达。该结果为后续进行深入研究其具体机制奠定了基础，为美洲大蠊提取物CⅡ-3 的临床应用提供新思路。
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