王子搏畅，陈婷婷，连亨宁，汪璐，田德兴，胡绳，曲远清，黄小露，马李杰#，肖贞良
西部战区总医院1呼吸与危重症医学科，3检验科，成都 610083
2武装警察部队工程大学基础部，西安 710086
国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）的数据显示，肺癌的发病率及病死率均逐年攀升，死亡人数已占全球肿瘤的18.4%，居肿瘤性疾病首位[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%以上，并且约75%的NSCLC患者在诊断时已是晚期。因此，提高NSCLC的早期诊断能力具有重大的临床意义[2-3]。现阶段主要采用影像学检查及血清肿瘤标志物检测作为肺癌复查的主要方法，单一血清肿瘤标志物对NSCLC的复查能力有限，临床采用多种肿瘤标志物联合检测进行筛查[4-7]。有研究显示，人附睾蛋白4（human eididymis 4，HE4）在NSCLC患者血清中表达增高，且联合其他肿瘤标志物检测对NSCLC的早期诊断具有一定的价值[8-10]。本研究探讨HE4在NSCLC患者血清中的表达及其对NSCLC的诊断价值，现报道如下。
1.1 研究对象
选取2018年6月至2020年1月于西部战区总医院首次确诊的97例NSCLC患者作为肺癌组。纳入标准：①年龄≥18岁；
②首次经病理活检确诊为肺癌。排除标准：①合并心、肺、肝、肾功能不全；
②合并急慢性感染；
③合并急慢性颅内出血；
④合并影响凝血功能的因素；
⑤既往经过化疗、放疗或手术治疗。97例NSCLC患者中，男性55例，女性42例；
平均年龄（60.89±9.89）岁；
腺癌78例，鳞状细胞癌17例，未明确分型2例；
临床分期：Ⅰ期41例，Ⅱ期7例，Ⅲ期18例，Ⅳ期31例。另选取同期在西部战区总医院体检中心进行体检的47例健康者作为对照组，其中，男性37例，女性10例；
平均年龄（50.98±5.33）岁。两组研究对象性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。
1.2 标本采集
呼吸与危重症医学科医师根据入院患者胸部CT影像、血清肿瘤标志物检测结果及临床症状等临床资料，筛选初步诊断为NSCLC的患者，由检验科医师留取上述患者临床检测后拟废弃的血清，置于-80℃冰箱用于本研究。血清制备按照检验科相关操作流程进行，具体为静脉血4 ml在3 h内以4000 r/min离心10 min分离血清。此法既未增加患者生理痛苦，也未产生额外费用。对照组（健康体检人员）采用同样的方法收集血清。
1.3 检测方法
采用化学发光法检测肺癌组和对照组研究对象血清中癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）、糖类抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）水平，全自动酶联免疫分析仪为贝克曼公司的DXI800，测定试剂为对应原装试剂，操作步骤及检测过程均严格按照试剂盒说明书及仪器操作指南进行。采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测肺癌组和对照组研究对象血清中HE4水平，经洗涤后加入含有HE4抗原的待测血清样品，如待检样品中有HE4抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记的特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为HE4抗原的量，具体实验步骤严格按照试剂盒使用说明书进行操作。
1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验；
服从正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；
不服从正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用双样本Kolmogorov-Smirnov检验或独立样本Kruskal-WallisH检验；
采用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析不同肿瘤标志物对肺癌的诊断效能；
以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 肺癌组与对照组肿瘤标志物水平的比较
肺癌组患者血清 HE4、CEA、CA19-9、CA125水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）
表1 肺癌组与对照组研究对象各肿瘤标志物水平的比较[M（ P25， P75）]
2.2 不同临床分期NSCLC患者血清肿瘤标志物水平的比较
Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者血清中HE4、CEA、CA19-9、CA125的表达水平随着临床分期的升高而升高（P＜0.01），其中，Ⅲ期患者血清中HE4、CA19-9表达水平低于Ⅱ期患者，可能与样本量少有关。（表2）
表2 不同临床分期NSCLC患者血清肿瘤标志物水平的比较[M（ P25， P75）]
2.3 不同性别NSCLC患者血清肿瘤标志物水平的比较
男性NSCLC患者血清HE4表达水平高于女性患者，差异有统计学意义（P=0.030）。不同性别NSCLC患者CEA、CA19-9、CA125水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）
表3 男性和女性NSCLC患者血清肿瘤标志物水平的比较[M（ P25， P75）]
2.4 有无远处转移NSCLC患者血清肿瘤标志物水平的比较
本研究入组的NSCLC患者中，67例无远处转移（M0期），30例有远处转移（M1期）。有远处转移的NSCLC患者血清HE4、CEA、CA19-9、CA125水平均明显高于无远处转移患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表4）
表4 有无远处转移NSCLC患者血清肿瘤标志物水平的比较[M（ P25， P75）]
2.5 血清肿瘤标志物诊断NSCLC的ROC曲线分析
本研究采用ROC曲线分析HE4、CEA、CA125、HE4联合CEA以及HE4联合CA125对NSCLC的诊断价值。结果表明，CA125、CEA单独检测诊断NSCLC的曲线下面积分别为0.553、0.577，均低于HE4（0.815）；
HE4联合CEA、HE4联合CA125检测诊断NSCLC的曲线下面积分别为0.822、0.843。另外，与CEA和CA125相比，HE4单独检测时诊断NSCLC的灵敏度最高，为0.742。此外，HE4与CEA或CA125联合检测时可提高诊断NSCLC的特异度，从HE4的0.787分别提高到0.894、0.915。（表5、表6、图1）
表5 各肿瘤标志物单独及联合检测诊断NSCLC的ROC曲线分析
表6 各肿瘤标志物单独及联合检测对NSCLC的诊断效能
图1 各肿瘤标志物单独及联合检测诊断NSCLC的ROC曲线
多数肺癌患者在早期无明显临床症状，不易被发现，确诊时已为中晚期，错过最佳治疗时机[11]。因而高特异性的肿瘤标志物对于提高肺癌的早期诊断率意义重大。
HE4是一种人附睾上皮细胞分泌的小分子糖蛋白，属于乳清酸性4-二硫键核心家族。HE4不仅表达于人生殖道上皮细胞，也表达于近端呼吸道上皮细胞[12]，HE4既能作为卵巢癌的血清标志物，也可应用于肺癌的诊断。近年来大量研究证实，NSCLC患者组织及血清中HE4表达升高，可能成为诊断NSCLC的高特异性肿瘤标志物，也可能是疗效及预后评估的客观指标[13-15]。
刘政宏等[16]选择124例NSCLC患者为观察组，另选取同期96例健康体检者为对照组，发现HE4在NSCLC患者组织及血清中表达升高。肖然等[17]对214例肺癌患者及76例健康者进行血清HE4、CEA、细胞角质蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）水平检测也发现，肺癌患者HE4水平显著高于健康者，并且，HE4参与的联合检测对NSCLC的诊断效能优于CYFRA21-1和CEA。另外，史永久等[18]开展的HE4对肺癌诊断价值的Meta分析也表明，HE4在NSCLC诊断中具有灵敏度高、特异性强的特点。本研究结果显示，NSCLC患者血清HE4水平明显高于健康人群，达到6倍，而CEA、CA125两个指标在NSCLC患者血清中的水平则仅为健康人群的1～2倍，这与Zeng等[19]的研究结果一致，HE4对NSCLC患者的诊断具有更高的灵敏度和特异度。对于不同临床分期的NSCLC患者，本研究发现，Ⅳ期患者血清HE4、CEA、CA19-9、CA125水平均高于Ⅰ～Ⅲ期患者，其中HE4尤为显著，提示血清HE4水平与NSCLC的疾病进展存在一定关系，李婷娜等[20]亦有类似发现。
目前独立用于NSCLC诊断的肿瘤标志物特异度和灵敏度均不高，因此本研究特别分析了HE4及其他指标联合检测在NSCLC诊断中的应用价值。在王强等[21]的研究中，ROC曲线分析显示，血清HE4诊断肺癌的特异度为72.70%，HE4联合CEA、CYFRA21-1和NSE诊断肺癌的特异度则提升为81.80%。陈波等[22]发现，HE4、CYFRA21-1和组织多肽特异性抗原（tissue peptide-specific antigen，TPS）联合检测诊断NSCLC的灵敏度较单项检测明显增高。Korkmaz等[23]也通过ROC曲线分析指出，当HE4与CYFRA21-1联合检测时诊断价值进一步提高。本研究中的ROC曲线分析显示，HE4联合CEA或CA125检测的曲线下面积均大于HE4单独检测，特异度由HE4单独检测时的78.7%提升为89.4%和91.5%，说明HE4联合CEA或CA125检测诊断NSCLC的特异度进一步提高，因此临床可积极采用HE4参与的肿瘤标志物联合检测，以便对肺癌早发现早治疗，提高后续治疗效果及生存率。另外，本研究的重要发现是，有远处转移患者血清HE4水平明显高于无远处转移患者，高达4倍，说明HE4的表达水平有可能成为判断NSCLC患者有无转移发生的重要指标。Weissensteiner和Babusikova[24]的研究也指出，HE4浓度的升高对肺癌患者骨转移的诊断有重要意义。
综上所述，血清HE4是比CEA、CA125、CA19-9诊断效能更高的NSCLC诊断标志物；
本研究发现，有远处转移患者血清HE4水平明显高于无远处转移患者，提示其可能成为判断有无转移发生的重要指标。另外，本研究结果证实，男性NSCLC患者血清HE4水平高于女性，并且，HE4与CEA或CA125联合检测可显著提高诊断NSCLC的特异度。本研究仍有不足，首先，本研究是纳入样本量较少的单中心研究，存在个体差异导致的数据偏倚可能；
其次，本研究尚不够深入，未能充分阐明HE4联合其他肿瘤标志物对NSCLC诊断、分型、预后等方面的意义。相信随着对HE4研究的不断推进，HE4在NSCLC诊断与治疗中的应用价值会日趋明确。