高晓黎， 王子航， 单 宇， 谢湘云,2， 常占瑛,2， 王 梅
(1新疆医科大学药学院；
2新疆及中亚特色医药资源教育部工程研究中心；
3新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室， 乌鲁木齐 830017)
2019年12月，中国湖北省武汉市报告了不明微生物引起的病毒性肺炎。2020年1月3日，中国国家病毒疾病控制和预防研究所(IVDC)的科学家通过结合Sanger测序、Illumina测序和纳米孔测序鉴定出新的人类感染冠状病毒[1]。国际病毒分类委员会将该病毒命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(Severeacute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)[2]，世界卫生组织将其引起的肺炎定义为Corona Virus Disease 2019 简称 COVID-19[3]。由于 COVID-19具有较强的传染性并造成较大范围的传播，世界卫生组织宣布新冠肺炎构成国际关注的突发公共卫生事件[4]。2022年12月26日，国家卫生健康委员会发布公告，将新型冠状病毒肺炎更名为新型冠状病毒感染，简称新冠感染。
以中药甘草中活性成分三萜类化合物为主药研发上市的制剂，主要有甘草甜素片、复方甘草酸苷片、复方甘草酸苷注射液、复方甘草酸单铵S注射液以及对其分离α单体为主成分的甘草酸二铵肠溶胶囊和异甘草酸镁注射液等。由于甘草酸类制剂具有抗炎症作用、免疫调节作用(对T细胞活化的调节作用；
对γ干扰素的诱导作用；
活化NK细胞作用；
促进胸腺外T淋巴细胞分化作用)、对实验性肝细胞损伤的抑制作用，甘草酸苷有抑制由四氯化碳所致的肝细胞损伤作用、抑制病毒增殖和对病毒的灭活等药理作用，在2003 年曾作为治疗严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome，SARS)有效药物参与临床的治疗。Cinatl等[5]分离了德国法兰克福大学临床中心SARS患者的冠状病毒，体外对比分析了利巴韦林、6-氮尿苷、吡唑呋喃菌素、麦考酚酸和甘草酸苷抗严重急性呼吸综合征样冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)活性，结果显示甘草酸苷能够显著抑制SARS-CoV复制，且在病毒复制早期能抑制病毒吸附和侵入宿主细胞，其抗SARS-CoV活性最强。
2003年SARS疫情之后国内外学者对甘草酸苷用于SARS-CoV及其他病毒的有效性与抗病毒机制开展了研究，邱振宁对此发表综述[6]。根据这些研究基础，2020年杨磊等[7]进行了“复方甘草酸苷治疗新型冠状病毒肺炎的可行性分析”的研究。2020年4月，中国药学会医院药学专业委员会特组织临床和药学专家，参考国内外最新的诊疗方案和研究成果，并结合国内各地新冠感染患者的救治经验，制定出《新型冠状病毒肺炎临床合理用药专家共识》中指出口服甘草酸二铵+维生素C可用来防治新冠感染导致的细胞因子风暴[8]。空军军医大学西京医院重症医疗队建议“新冠感染合并急性肝损伤时可使用甘草酸类制剂抗炎保肝”[9]。与此同时，新冠感染疫情发生以来，国内外学者对甘草酸及其相关制剂抗新冠感染的作用机制开展了一系列研究，以期从天然产物中寻找有效的治疗药物，为甘草酸类药物制剂治疗新冠感染提供理论依据。
SARS-CoV-2属于 β- 冠状病毒[10]，单链基因组RNA为29 891个核苷酸，编码9 860个氨基酸，G+C含量为38%，其基因组包含两个非翻译区和一个编码多蛋白的长开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，并按照5’-复制酶-3’的顺序排列[11]。ORF1a和ORF1b两个主要ORF与核糖体框架移位重叠，包含基因组的三分之二，分别翻译为多聚蛋白pp1a和pp1ab[12]，这些多聚蛋白经病毒蛋白酶加工，产生非结构蛋白(Nonstructural，Nsps)，Nsp1 至 Nsp16[13]。Nsps 和一些宿主因子在双膜囊泡内形成复制转录复合物，是病毒基因组复制和转录的中心枢纽[14]。其余三分之一的基因组具有重叠的ORF，编码四种主要结构蛋白：棘突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)，以及一些辅助蛋白[15]。在病毒感染期间，SARS-CoV-2通过S蛋白与人类血管紧张素转换酶2(Angiotensinconverting enzyme 2，ACE2)结合介导包膜与宿主细胞膜直接融合，将其基因组注射到宿主细胞中[16]。进入宿主细胞后，SARS-CoV-2未被包覆的向导RNA释放到宿主细胞细胞质中，并由宿主核糖体翻译。翻译产物的多聚蛋白pp1a和pp1ab被病毒蛋白酶PLpro和Mpro蛋白水解成Nsp1-16并在宿主细胞内形成RTC进行复制与转录，RNA(+)链首先复制到RNA(-)链，然后负链用于复制到RNA(+)链以进行新病毒粒子组装或转录亚基因组mRNAs，这些亚基因组mRNA被翻译成结构蛋白S、M、E、N和辅助蛋白。S、M和E蛋白进入内质网，N蛋白附着在基因组RNA(+)链上，产生核蛋白复合物[17]。核蛋白复合物和结构蛋白移到内质网高尔基体中间区，病毒粒子在那里以小囊泡的形式聚集、成熟并从高尔基体萌发。这些囊泡进入宿主细胞膜，通过胞吐作用释放到细胞外区域。释放的病毒粒子感染一组新的细胞，导致疾病进展[18]。
新冠感染的症状与普通感冒相似，包括发烧、咳嗽和呼吸急促[19]，感染可导致肺炎， 《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》中论述“严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)、脓毒血症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等”[20]。
2.1 肺部病理特征新冠感染病理学检查结果显示，双肺纤维样肺泡损伤与细胞黏液样渗出物有关。右肺显示明显的肺细胞脱落和透明膜形成，提示ARDS。左肺组织表现为肺水肿伴透明膜形成，提示早期ARDS。双肺间质内可见以淋巴细胞为主的单核细胞浸润。肺泡内可见多核合胞体细胞，肺细胞不典型增大，其特征为细胞核大，嗜两性颗粒细胞质，核仁突出，提示病毒性细胞病变样改变[21]。
2.2 新冠感染导致ARDSARDS是一种危及生命的肺部疾病，阻止足够的氧气进入肺部和循环，导致大多数呼吸系统疾病和急性肺损伤的死亡[22]，在人类SARS-CoV-2感染的致命病例中，个体表现出需要机械通气的严重呼吸窘迫，组织病理学结果也支持ARDS[23]。
2.3 免疫功能障碍在重症新冠感染患者中，嗜酸性粒细胞减少和淋巴细胞减少以及 CD4+和 CD8+T 细胞、B细胞和自然杀伤细胞的严重降低是一个共同特征[24]。在感染后几天内几乎普遍检测到病毒特异性IgM、IgG和IgA以及中和IgG抗体所证明触发强烈的体液免疫反应[25]。
2.4 细胞因子风暴SARS-CoV-2引起的组织损伤导致促炎细胞因子的过度分泌和其他促炎细胞(如粒细胞和巨噬细胞)的募集，这导致细胞因子分泌和白细胞募集形成“瀑布效应”，导致全身炎症反应，称为巨噬细胞激活综合征或继发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症，俗称细胞因子风暴(Cytokine storm，CS)[26]。感染SARS-COV-2的患者血浆中出现以下情况：IL-1、IL-1RA、IL-7、IL-8、IL-10、IFN-γ、MCP-1、MIP-1α、G-CSF和TNF-α[27]，这些细胞因子升高的水平与疾病的严重程度相关。CS通过多途径介导炎症反应。
3 抗新冠感染的治疗药物
3.1 莫诺拉韦莫诺拉韦(Molnupiravir)由默沙东公司(默克)与Ridgeback生物治疗公司共同开发。是一款广谱抗病毒药物。最初是针对委内瑞拉马脑炎病毒而开发，后来被用于流感病毒、呼吸道轮状病毒等多种病毒的治疗。Molnupiravir的作用机制不是直接消灭或抑制病毒，而是诱导病毒RNA聚合酶和自己结合，进行错误复制(突变)，最终合成没有感染性的假病毒。该药物的作用机制决定了其需要在感染早期服用，才能取得较好的效果[28]。2022年12月29日，国家药监局根据《药品管理法》相关规定，按照药品特别审批程序，进行应急审评审批，附条件批准默沙东公司新冠病毒治疗药物莫诺拉韦胶囊(商品名称：利卓瑞/LAGEVRIO)进口注册。莫诺拉韦是口服小分子新冠病毒治疗药物，能够降低轻中度新冠感染患者的住院率及病死率[29]。
3.2 奈玛特韦-利托那韦辉瑞开发的奈玛特韦-利托那韦(商品名：Paxlovid)已在多个国家和地区获得了治疗新冠感染的紧急使用授权。Paxlovid是由利托那韦和奈玛特韦组成的复合药。利托那韦早就是一种抗艾滋病药物，能够破坏病毒中酶的正常功能，使病毒无法完成组装和释放。而奈玛特韦则是新冠病毒主要蛋白酶Mpro的拟肽类抑制剂，能够让Mpro无法处理多蛋白前体，从而抑制新冠病毒在人体内的增殖[30]。Paxlovid被证明可降低轻中度新冠感染患者的住院风险与重症新冠感染患者的死亡率[31]。
3.3 阿兹夫定2021年，阿兹夫定(Azvudine)作为抗艾滋病药物获批上市。2022年7月，阿兹夫定获得国家药监局紧急附加条件批准，成为中国紧急批准授权使用的国产抗新冠口服药。阿兹夫定的作用机制和Molnupiravir相似，都是通过“诱骗”RNA病毒与自己结合来抑制病毒的复制[32]。Paxlovid以及阿兹夫定目前在中国临床一线的用途主要有两个：一是对高危人群进行干预用药，二是用于重症、危重症感染者的抗病毒治疗。
3.4 VV116VV116 是我国自主研发的对 SARS-CoV-2 具有强效活性的口服抗病毒药，属于 SARS-CoV-2的RNA复制酶小分子抑制剂。在III期临床试验中VV116在持续临床康复时间、临床症状恢复时间、新冠病毒转阴时间均非劣于奈玛特韦-利托那韦，且不良事件更少[33]。
3.5 羟氯喹羟氯喹具有广谱抗病毒作用，并具有调节免疫的 功能，可以显著下调多种炎症因子的表达[34]。已在临床用于抗新冠病毒的治疗。但长期应用可导致严重锥体外系反应、抑制窦房结、心律失常等副作用[35]。
3.6 糖皮质激素糖皮质激素具有强效抗炎与免疫抑制作用，可能会降低新冠感染患者的死亡率，常用于患者氧合指标恶化或出现ARDS症状[36]。但其使用具有一定的争议，较大剂量的糖皮质激素产生的免疫抑制作用会延缓机体清除新冠病毒并产生糖尿病、骨质疏松等不良反应。
3.7 托珠单抗新冠重症感染患者可能会出现细胞因子风暴，促炎性细胞因子IL-6的生成可能是导致细胞因子风暴的重要途径[37]。IL-6拮抗剂托珠单抗可用于IL-6水平升高的重症患者。但其具有严重不良反应，包括致死性的超敏反应，且有活动性结核感染者禁用[38]。
甘草酸及其制剂可通过直接作用SARS-CoV-2产生良好的抗病毒作用；
也可通过靶向宿主产生抗炎、类皮质激素样作用和免疫调节作用，抑制细胞因子风暴，缓解免疫损伤导致的ARDS。
4.1 甘草酸及其制剂抗SARS-CoV-2作用机制
4.1.1 阻断S蛋白 运用表面等离子共振技术发现甘草酸对SARS-CoV-2的S1亚单位表现出高度亲和力并具有浓度依赖性，表明甘草酸可能通过影响S蛋白与人 ACE2 蛋白之间的相互作用而具有潜在的抗SARS-CoV-2活性。通过纳米比特技术发现甘草酸在低浓度下破坏了SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2的相互作用，表明甘草酸能有效抑制 SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2相互作用[39]，并且甘草酸阻断S蛋白结合超过95%[40]。甘草酸在Vero E6细胞中抑制了SARS-CoV-2的复制，并在高剂量时不表现出细胞毒性[41]。
4.1.2 调节跨膜丝氨酸蛋白酶2 跨膜丝氨酸蛋白酶2(Transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)可以切割SARS-CoV-2的S蛋白，促进SARS-CoV-2与细胞膜的融合[42]。甘草酸可以抑制TMPRSS2的表达[43]，阻止SARS-CoV-2进入细胞。
4.1.3 结合Nsp-15 通过分子对接和分子动力学模拟发现甘草酸与SARS-CoV-2的Nsp-15内切核糖核酸酶的结合位点有强相互作用[44]，推测甘草酸可抑制SARS-CoV-2的 复制。
4.1.4 结合ACE2 Sessu等[45]研究发现，运用分子对接技术预测了甘草酸在SARS-CoV-2刺突蛋白受体结构域处有效结合，且在ACE2结合界面表现相似的结合亲和力，结果表明甘草酸可用于制定抗SARS-CoV-2的辅助疗法。中山大学第三附属医院团队[46]发现甘草酸苷具有能与 ACE2 的分子结合从而抑制SARS-CoV 和SARS-CoV-2入侵细胞的潜能，因其可减轻CS、预防ARDS和多脏器损伤而减少炎症性疾病重症化，而且还具有抗病毒潜能，建议将甘草甜素尝试用于新型冠状病毒感染的治疗。
4.2 甘草酸及其制剂靶向宿主抗新冠感染作用机制
4.2.1 抗炎与免疫调节作用 甘草酸可明显抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的ARDS中IL-1β、MCP-1、COX2、HMGB1等炎症因子的产生，并通过上调ACE2和抑制caveolin-1/NF-κB 信号通路减轻ARDS[47]。甘草酸能够显著减轻肺损伤，并减少了LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-1β和HMGB1的产生。甘草酸诱导的自噬表现为通过上调LC3-II/I和Beclin-1的蛋白水平并下调SQSTM1/P62来增加自噬体的数量。通过调节PI3K/AKT/mTOR通路相关的自噬抑制ARDS炎症因子的产生[48]。HMGB1是炎症过程中重要的细胞外介质，并且能够调节 ACE2 受体的表达，对SARS-CoV-2 进 入 宿 主 细 胞 有 重 要 作 用 ，并 且HMGB1 是炎症的报警分子[49]。甘草酸作为 HMGB1的天然抑制剂，能够直接与HMGB1结合抑制其细胞因子活性[50]。在气管内LPS给药之前用甘草酸单铵预处理显著降低肺组织湿干重比、支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的总白细胞数和中性粒细胞百分比，并以剂量依赖性方式降低肺组织中的髓过氧化物酶活性。用甘草酸单铵预处理也显著提高了超氧化物歧化活性并诱导了BALF中的丙二醛含量，抑制了肺组织中的环磷酸腺苷磷酸二酯酶活性的增加。此外，它可以上调ARDS肺组织中白细胞介素IL-10的水平，下调TNF-α的水平。这些结果表明，甘草酸单铵对LPS诱导的ARDS的抗炎作用是由于其抑制cAMP-PDE活性、氧化应激及其对细胞因子作用的调节的能力。因此，使用甘草酸单铵有利于治疗ARDS[51]。LPS在细胞中诱导TLR2上调，TLR2过表达激活TLR信号通路促进ARDS。甘草酸处理后，TLR2的表达降低。此外，还发现ARDS小鼠的炎症细胞数量、胶原沉积、MIP-2、KC、IL-4、IL-6、GM-CSF 和IFN-γ表达增加，而甘草甜素可改善这种情况[52]。
4.2.2 保肝与保护细胞膜作用 甘草酸苷通过阻断花生四烯酸在起始阶段的代谢水平，保护肝细胞膜，具有保肝降酶作用[53]。通过对复方甘草酸苷临床治疗SARS分析的结果表明，甘草酸苷因具有糖皮质激素的功能，其可产生保护细胞膜的作用，具有保肝降酶的作用[54-55]。Kroes等人实验表明甘草酸苷可以促进肝细胞再生，是肝细胞的保护剂[56]。
4.3 甘草酸类制剂在抗新冠感染中的临床应用2020年初武汉新冠感染疫情初期，武汉大学药学院专家采用已上市甘草酸制剂对居家隔离治疗的患者进行尝试性救助。复方甘草酸苷片(每片含甘草酸单铵盐(以甘草酸苷计)25 mg、甘氨酸25 mg、DL-甲硫氨酸25 mg)曾在新疆新冠定点诊疗医院用于新冠感染的临床治疗，特别是对并发肝损伤患者的治疗发挥了协同抗病毒作用，替代或减少激素使用(缓解炎症风暴)的作用。根据中国临床试验注册中心官网公开信息，甘草酸二铵肠溶胶囊联用维生素C片在治疗新型冠状病毒肺炎的有效性和安全性的临床研究，已完成临床试验注册备案登记[57]。
在近三年抗击新冠感染的过程中，将甘草制剂运用于临床治疗已被多篇文献报道。周外民等将甘草酸二铵用于治疗新冠感染，实验结果表明甘草酸可降低肝损伤不良反应[58]。李璐等[59]将新冠感染合并肝功能异常患者分为观察组与对照组。观察组患者出现肝功能异常后使用甘草酸二铵治疗，对照组患者使用其他保肝药治疗，所有患者均按照《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》进行治疗，发现甘草酸二铵治疗新冠感染合并肝功能异常患者可有效抑制患者的炎症反应并保肝。何蓉会等[60]使用甘草酸二铵联合抗病毒治疗了重症新冠感染患者。广西地区新冠感染定点医院采用阿比多尔联合甘草酸二铵肠溶胶囊治疗新冠感染[61]。Elsersy等通过对照临床研究发现聚维碘酮和甘草酸鼻腔口腔联合喷雾剂可加速新冠感染患者在疾病早期的实验室和临床恢复，并减少病毒的家庭传播[62]。Gomma等将甘草酸联合乳香酸治疗新冠感染轻中度患者取得显著疗效[63]。武汉市第三医院对349例新冠感染患者给予甘草酸二铵或者异甘草酸镁辅助治疗，发现其能抑制炎症反应，预防肺纤维化，延迟器官损伤[64]。王涛等[65]在常规治疗的基础上加用异甘草酸镁注射液与甘草酸二铵肠溶胶囊，发现联合甘草酸制剂可缩短新冠感染患者临床症状持续时间。孙信林等[66]对新冠感染患者给予甘草酸二铵肠溶胶囊预防性保肝治疗，发现甘草酸二铵对新冠感染患者的肝功能具有保护作用。刘积庆等[67]给予危重型新冠感染致肝损伤患者异甘草酸镁注射液，发现异甘草酸镁注射液在危重型新冠感染致肝损伤患者中疗效明显。Liu等[68]给予189名新冠感染合并肝损伤的患者甘草酸二铵与异甘草酸镁，发现其在改善肝功能、抑制炎症、增强免疫方面具有显著疗效。
综上所述，甘草酸类制剂通过靶向病毒与宿主，发挥多重机制，治疗早期新冠感染。已上市的甘草酸药物制剂在国内外抗击新冠疫情中已获得宝贵的临床“人用经验”，有必要开展复方甘草酸苷片等甘草酸类制剂治疗新冠感染的系统规范的临床研究，为规范临床应用方案提供依据。
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