张 亮， 唐 城， 薛红瑞， 谢湘云,3， 刘晓航， 单 宇， 高晓黎,3
(1新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830017；
2新疆特丰药业股份有限公司， 乌鲁木齐 830000；
3新疆及中亚特色医药资源教育部工程研究中心， 乌鲁木齐 830017；
4新疆第二医学院， 新疆 克拉玛依 834000)
复方甘草酸苷片最早由日本Minophagen pharmaceutical Co., Ltd.公司研发，于1954年以商品名美能®，英文名：Stronger Neo-Minophagen C在日本获批上市[1-2]，上市剂型为糖衣片剂，每片含甘草酸苷25 mg，甘氨酸25 mg，DL-蛋氨酸25 mg。2018年国家药审中心公布的第十三批参比制剂目录(第38号通告)中指定美能®为复方甘草酸苷片仿制药质量与疗效一致性评价(以下简称一致性评价)的参比制剂[3]。仿制药一致性评价研究内容主要包括药学一致性研究和生物等效性研究两大部分。在固体制剂药学一致性研究中，须建立具有区分力的溶出曲线测定方法，用以评价仿制制剂和原研制剂在不同溶出介质中体外溶出曲线的相似性。保证仿制药和原研制剂在体外多种溶出介质中溶出曲线的相似性，可提高体内生物等效性试验的成功率。为了开展复方甘草酸苷片仿制药一致性评价研究，本研究以参比制剂美能®为研究对象，建立高效液相色谱法测定其中甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸3种活性成分的含量测定方法，按照《中国药典》2020版第四部附录药品质量标准分析方法验证指导原则进行分析方法验证[4]。参照《普通口服固体制剂溶出度试验技术指导原则》[5]，采用浆法，转速为50 r/min，选择与日本橙皮书[6]中相同的溶出介质：pH1.2盐酸溶液、pH4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液与水为溶出介质，测定了3个批次的复方甘草酸苷片参比制剂美能®中甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸3种活性成分在4种不同的溶出介质中的含量，计算平均累积溶出百分率，绘制溶出曲线，为复方甘草酸苷片质量控制和开展固体仿制药溶出曲线的相似性评价提供参考依据。
1.1 仪器BSA224S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；
Agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦)；
自动溶出仪(上海富科思仪器有限公司)；
真空脱气机(上海富科思仪器有限公司)。
1.2 试药甘草酸铵(中国食品药品检定研究院，110731-202021) ，甘氨酸(中国食品药品检定研究院，140689-201605)，DL-蛋氨酸(SIGMA，MKBT7964V)，复方甘草酸苷片(美能®)(Akiyama Jozai Co.,Ltd.，批号19125/19188/19221)。
2.1 色谱条件
2.1.1 甘草酸铵色谱条件[7]色谱柱：
C18(4.6×150 nm，5 μm)；
流动相：乙腈-冰乙酸水溶液(35∶65)；
检测波长：254 nm；
柱温：30℃；
流速：1.0 mL/min；
进样体积：20 μL；
运行时间：15 min。
2.1.2 氨基酸检测色谱条件 色谱柱：SHIM-PACK AMINO-NA(6.0×100 mm，5 μm)；
流动相：柠檬酸钠溶液；
荧光检测器；
检测波长：激发光波长350 nm，发射光波长450 nm；
柱温：60 ℃；
流速：0.4 mL/min；
进样体积：对照品20 μL，样品2 μL；
运行时间：15 min；
柱后衍生条件：衍生试剂：邻苯二甲醛溶液；
流速：0.3 mL/min；
衍生温度：60℃。
2.2 溶液配制
2.2.1 甘草酸铵对照品贮备液 称取甘草酸铵对照品12.5 mg置50 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，摇匀，即得甘草酸铵对照品贮备液。
2.2.2 氨基酸对照品储备液制备
2.2.2.1 甘氨酸对照品储备液 称取甘氨酸对照品12.5 mg置50 mL量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，摇匀，作为甘氨酸对照品储备液。
2.2.2.2 DL-蛋氨酸对照品储备液 称取DL-蛋氨酸对照品25 mg置100 mL量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，摇匀，作为DL-蛋氨酸对照品储备液。
2.2.2.3 甘氨酸-DL-蛋氨酸混合对照品溶液 分别量取甘氨酸对照品储备液、DL-蛋氨酸对照品储备液各1 mL，置同一100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，作为甘氨酸-DL-蛋氨酸混合对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液 取供试品20片，精密称定，计算平均片重，研磨，精密称定1/10平均片重供试品至100 mL容量瓶中，加入各介质振摇并超声15 min，然后稀释并定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。
2.3 溶出介质配制
2.3.1 水介质配制 自制纯化水采用脱气装置经37℃脱气30 min。
2.3.2 pH1.2介质的配制 取氯化钠2.0 g，加水适量使溶解，加盐酸约5 mL，加水稀释至1 L，混匀后用盐酸调pH至1.2。
2.3.3 pH4.0介质的配制 取十二水合磷酸氢二钠17.91 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，即得0.05 mol/L的磷酸氢二钠溶液；
另取一水合柠檬酸(亦称枸橼酸)5.25 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，即得0.025 mol/L的柠檬酸溶液。用柠檬酸溶液调节磷酸氢二钠溶液，混匀后用盐酸调pH至4.0。
2.3.4 pH6.8介质的配制 称取磷酸二氢钾1.70 g和无水磷酸氢二钠1.775 g，用水溶解至1 000 mL，用磷酸调节pH至6.80。
2.4 4种溶出介质中甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸分析方法验证
2.4.1 系统适用性试验 甘草酸苷系统适用性：取甘草酸铵对照品溶液按“2.1.1”项色谱条件连续进样6针，甘草酸苷峰保留时间的RSD为0.27%，峰面积的RSD为0.13%，理论板数按甘草酸苷峰计算不低于2 000，拖尾因子不大于2.0，表明系统适用性良好。氨基酸系统适用性：取甘氨酸、DL-蛋氨酸混合对照品溶液按照“2.1.2”项色谱条件连续进样6针，4种介质中，甘氨酸峰与DL-蛋氨酸峰的分离度均大于1.5，pH1.2、pH 4.0、pH 6.8及水介质中甘氨酸峰和DL-蛋氨酸峰面积的RSD分别为0.15%、0.17%；
0.71%、0.80%；
0.39%、0.53%；
0.10%、0.18%，表明系统适用性良好。
2.4.2 专属性测定 甘草酸苷专属性：取溶剂对照、空白辅料样品对照、对照品、供试品各20 μL，按“2.1.1”项色谱条件进样测定，结果表明，甘草酸苷保留时间约为12.9 min，4种介质与辅料均不干扰甘草酸苷测定，方法专属性良好，代表性图谱如图1所示。氨基酸专属性：取溶剂对照、空白辅料样品对照、供试品各20 μL，对照品2 μL，按“2.1.2”项色谱条件进样测定，结果表明，甘氨酸保留时间约为8.3 min，DL-蛋氨酸约为13.0 min，4种介质与辅料均不干扰甘氨酸和DL-蛋氨酸测定，方法专属性良好，代表性图谱如图2所示。
注：
A为水介质， B为阴性对照， C为对照品溶液， D为供试品溶液。
注：A为水介质，B为阴性对照，C为对照品溶液，D为供试品溶液。
2.4.3 线性范围考察 甘草酸苷线性范围考察：取“2.2.1”项下对照品储备液5 mL，置50 mL量瓶中，用4种介质定量稀释制成甘草酸苷浓度分别为1.25、5、10、15、20 μg/mL的溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标线性回归，4种介质中质量浓度在1.065～17.03 μg/mL范围内线性良好。氨基酸线性考察：取“2.2.2.3”项下对照品储备液5 mL，置50 mL量瓶中，用4种介质定量稀释制成甘草酸苷浓度分别为0.125、0.5、1、1.5、2 μg/mL的溶液，按照“2.1.2”项下色谱条件进样，测定甘氨酸和DL-蛋氨酸峰面积，测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标线性回归，4种介质中质量浓度在0.123 8～2.984 4 μg/mL范围内线性良好，标准曲线方程结果如表1所示。
2.4.4 准确度的测定 甘草酸苷的回收率考察：按处方量称取甘草酸单铵盐、空白辅料、甘氨酸、DL-蛋氨酸，置500 mL量瓶中，用各介质溶解并定容，超声20 min，5 000 r/min离心5 min取上清液；
再分别精密量取1、2.5、5、6 mL，置10 mL量瓶中，各浓度平行制备3份，分别用各介质溶解并定容，配制成20%、50%、100%、120% 4个浓度的供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样，计算回收率，结果见表2。氨基酸的回收率考察：取1/10平均片重辅料至100 mL容量瓶中，分别精密量取甘氨酸对照品储备液、DL-蛋氨酸对照品储备液各0.5 mL，置同一100 mL量瓶中，加各溶出介质溶解并稀释至刻度，摇匀，平行3份，得5 %回收率样品。取1/10平均片重辅料至20 mL容量瓶中，分别精密量取甘氨酸对照品储备液、DL-蛋氨酸对照品储备液各1 mL、各2 mL，分别置20 mL量瓶中，加各溶出介质溶解并稀释至刻度，摇匀，平行3份，得50%、100%回收率样品。按“2.1.2”项下色谱条件测定峰面积，计算回收率，结果见表2。
表1 甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸在4种介质中的线性方程
表2 甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸回收率结果/%
2.4.5 重复性测定 甘草酸苷重复性考察：取供试品20片，精密称定，计算平均片重，研磨，精密称定1/10平均片重供试品至100 mL容量瓶中，分别加入4种介质振摇并超声15 min，稀释并定容，得供试品溶液，平行制备6份，按照“2.1.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算甘草酸苷含量的RSD，结果见表3，在4种介质中甘草酸苷含量的RSD均小于2.00%，表明方法重复性良好。氨基酸重复性考察：取供试品20片，精密称定，计算平均片重，研磨，精密称定1/10平均片重供试品至100 mL容量瓶中，分别加入4种介质振摇并超声15 min，稀释并定容，得供试品溶液，平行制备6份，按照“2.1.2”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算甘氨酸和DL-蛋氨酸含量，结果见表3，在4种介质中甘氨酸和DL-蛋氨酸含量的RSD均小于2.00%，表明方法重复性良好。
表3 甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸重复性结果/%
2.4.6 样品稳定性试验 取供试品溶液，在室温下放置，分别在0、4、8、12、20、24、48 h各进样20 μL，按照“2.1.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算甘草酸苷含量的RSD，按照“2.1.2”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算甘氨酸和DL-蛋氨酸含量的RSD，结果见表4，在4种介质中供试品溶液室温放置48 h甘草酸苷含量、甘氨酸含量、DL-蛋氨酸含量与0时间相比无显著变化，RSD均小于2.00%，表明供试品溶液室温放置48 h稳定。
表4 甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸稳定性结果/%
2.5 复方甘草酸苷片溶出曲线测定采用浆法，转速为50 r/min，随机取复方甘草酸苷片12片，分别置于900 mL4种不同溶出介质中进行溶出实验，pH1.2的盐酸溶液和pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中分别在10、15、20、30、45、60、90、120 min取样7 mL；
pH6.8的磷酸盐缓冲溶液中和水介质中分别在5、10、15、20、30、45、60 min取样7 mL，同时在各取样时间点补充同体积溶出介质，经滤膜相容性考察，选择安谱-PEFE-水系0.22 μm滤膜过滤；
按照、“2.1.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，绘制甘草酸苷在4种介质中溶出曲线，结果见图3；
按照“2.1.2”项下色谱条件进样，测定峰面积，绘制甘氨酸和DL-蛋氨酸在4种介质中溶出曲线，甘氨酸溶出曲线结果见图4，DL-蛋氨酸溶出曲线结果见图5。
注：A为水介质，B为pH1.2盐酸溶液，C为pH 4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，D为pH6.8磷酸盐缓冲液。
注：A为水介质，B为pH1.2盐酸溶液，C为pH 4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，D为pH6.8磷酸盐缓冲液。
注：A为水介质，B为pH1.2盐酸溶液，C为pH 4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，D为pH6.8磷酸盐缓冲液
进行固体制剂溶出曲线测定[8]，首先要建立药物在溶出介质中专属性好和灵敏度高的含量测定方法，片剂溶出曲线测定的初始含量低，滤膜吸附对累积溶出百分率的影响不容忽视。滤膜的种类不同，对不同溶出介质中主成分的吸附作用不同[9-10]，本试验对滤膜相容性进行了考察。考察了同一规格安谱-PEFE-水系膜、岛津-水系膜、安谱-聚醚砜-水系膜、希波氏-有机系膜4种不同的滤膜对甘草酸苷的吸附作用，结果表明希波氏-有机系对4种介质中甘草酸苷吸附作用均比较明显，3种水系膜对水介质、pH4.0、pH6.8介质中甘草酸苷几乎无吸附作用，对pH1.2介质中甘草酸苷具有不同程度的吸附作用，安谱-PEFE-水系膜对甘草酸苷的吸附作用最弱，因此本实验选择使用安谱-PEFE-水系膜。
其次要考虑选择转篮法或浆法，溶出介质的体积[11]、搅拌速度外[12]，还需要根据制剂本身的特性，考虑被测成分在不同介质中的溶解度[13-14]、解离度等各种理化性质及在不同介质中的溶出行为，考察不同介质配制方法及溶出行为等对累积溶出百分率的影响。本试验观察到用柠檬酸盐和醋酸盐不同缓冲盐配制pH4.0介质测得的甘草酸苷累积溶出百分率明显不同，分析原因是复方甘草酸苷片处方中含有碳酸钙，碳酸钙与酸性溶液发生反应产生气体，可克服甘草酸在酸性溶液中溶解后形成凝胶状不易溶出的问题，有利于片剂迅速崩解溶出。柠檬酸酸性强于醋酸，与处方中碳酸钙的反应更剧烈，所以甘草酸苷在pH4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系中溶出快于pH4.0醋酸缓冲体系。另外缓冲溶液中离子强度也会影响片剂溶出度，离子强度越高溶出越快。影响离子强度的因素[15-16]有溶液中离子种类、离子的质量摩尔浓度、离子所带电荷，pH4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲缓冲溶液中离子种类较多、质量摩尔浓度及所带电荷也比较高，所以甘草酸苷的溶出更快。用pH4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液测得的溶出曲线与日本橙皮书网站公布的美能溶出曲线一致，因此，本实验采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲缓冲体系配制pH4.0介质。
复方甘草酸苷片的参比制剂美能®为糖衣片，本实验测得3批美能®在4种介质中溶出曲线显示，糖衣片具有延迟释放现象(即在前5～20 min溶出量小于10%，之后溶出量迅速提升)，以甘草酸苷为例，美能®糖衣片在pH1.2介质、水介质中的延迟释放时间为10 min；
在pH4.0介质和pH6.8介质中甘草酸苷的延迟释放时间为15 min。结合溶出测定中观察到的现象，糖衣片在溶出的过程中，首先糖衣层要经过约10～15 min的溶蚀开裂后慢慢脱落，片芯中的主成分才能释放出来，说明糖衣层是引起延迟释放的主要原因。
国产仿制药可在工艺上进一步优化与改进，在片剂生产过程中混料、制粒、压片、包衣等关键工艺过程进行控制，并对其与溶出行为的关系进行研究，在保证各主成分含量合格、制剂稳定的基础上，进一步保证批间溶出的均一性，全面提升仿制药的质量。
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