张妤亭 张 敏 王歆玮 吴海燕 黄维金 王佑春 郑源强 石艳春 陈国江
（内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室， 呼和浩特 010058）
埃博拉病毒病（Ebola virus disease，EVD）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）感染导致的一种致命的急性传染病，潜伏2～21 d 后出现症状，并导致严重的全身疾病，病死率为25%～90%［1］。EBOV 属于丝状病毒科EBOV属，该病毒属由扎伊尔EBOV等6个亚种组成［2-3］。EBOV是单股负链RNA病毒，基因组约19 kb，共编码7 种蛋白：核蛋白（nucleoprotein，NP）、聚合酶辅助因子VP35、基质蛋白VP40、糖蛋白（glycoprotein，GP）、转录因子VP30、核衣壳相关蛋白VP24、RNA 依赖的RNA 聚合酶L［4］。GP 是由GP1-GP2 异源二聚体组成的同源三聚体跨膜糖蛋白，被宿主蛋白酶切割为GP1 和GP2 两个亚基［5］。其中GP1介导病毒附着及受体结合，GP2促进膜融合［6-7］。
EBOV自1976年首次发现以来已引起多次暴发流行，也是引发疫情的主要病原体［8］。大量人与人传播为EBOV 提供了适应人类宿主的机会。对 2013-2016 年埃博拉流行过程的监测结果显示， EBOV Makona 整个基因组发生了突变［9-11］。虽然在流行期间检测到的大多数非同义突变可能对病毒的适应度影响不大，但其中一些突变可能增强了EBOV 在人类之间的传播。GP 蛋白的微小变化可以影响其介导病毒进入不同哺乳动物细胞的能力［12］。82V 是突变频率较高的一株突变体，在疫情早期出现并在传播中占主导，感染率迅速超过了母本Makona EBOV［13］。此外，一些研究人员将感染增强归因于I544，其通过增加周围氨基酸疏水性稳定GP 结构，对病毒-宿主膜融合至关重要［6，14-15］。有研究人员通过比较2013～2016年西非埃博拉爆发期间的1 610 个EBOV-Makona 病毒全长基因组序列，发现一些突变体在感染A549、Huh7 和BEAS-2B 细胞时感染力均有不同程度增强，其中A82V-I371V、
A82V-T230A、R29K-A82V、A82V-T206M、N107DP330S-G480D 和A82V-P202L-L239S 感 染 力 明 显 增强［16］。此外，研究者将病毒在Vero E6 中连续传代获得D552N 和I584L 突变体，突变后的病毒复制能力提高［17］。因此对于突变体的治疗尤为重要。
单克隆抗体由于其特异性以及高效性成为抗埃博拉药物研发的重要目标。目前已有1个单抗和2 个抗体鸡尾酒疗法——mAb114、ZMapp 和REGNEB3 进入临床研究，均靶向GP 蛋白［18-21］。mAb114、ADI-15946、rEBOV-520是从幸存者血液中分离出来的 单 抗［19，22-23］。其 中mAb114 主 要 作 用 于GP1 的RBD区，在非人灵长类动物感染EBOV 5 d后仍能够提供保护作用［24］。ADI-15946 和rEBOV-520 主要识别GP2，并对EBOV等3类假病毒均具有中和能力。
本实验室利用pSG3.ΔEnv.CMV.Fluc HIV骨架载体建立了含萤火虫荧光素酶报告基因的EBOV 系统，由于该重组质粒缺失HIV 的Nef、Env 和Vpr 基因，包装的假病毒仅能一次感染，无复制能力，可以在P2实验室中进行。据文献报道，肝、肾、肺是感染EBOV 早期重要的靶器官［25-28]。因此选择在Huh7、HEK293T 和A549 三个不同来源的细胞系上进行假病毒感染实验。另外考虑到单核巨噬细胞和树突状细胞是EBOV 感染靶细胞之一［25]，因此在THP-1细胞中评价了14 株埃博拉突变体假病毒的感染能力，并对3 株抗埃博拉抗体（mAb114、ADI-15946、 rEBOV-520）的功能活性进行检测，为应对EBOV 突变提供一定参考。
1.1 材料 HEK293T、Huh7、A549、THP-1 细胞由本实验室保存；
HIV 骨架质粒pSG3. ΔEnv. CMV.Fluc、EBOV（Genbank：A0A068J419）及 其 突 变 体A82V、T544I、D552N、A82V-D552N、A82V-T544ID552N、A82V-T230A 和A82V-I371V GP 表达质粒由中国食品药品检定研究院惠赠；
N107D-P330SG480D 和A82V-P202L-L239S 由苏州金唯智生物 科技有限公司合成；
EBOV 单抗（rEBOV-520、ADI-15946、mAb114）由本实验室制备和保存；
大肠杆菌TOP10 感受态细胞（北京擎科生物科技有限公司）；
基因合成及测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成；
无内毒素大提试剂盒（货号：W9811，北京天根生物科技有限公司）；
DMEM培养基（货号：8121489，Gibco 公司）；
胎牛血清（货号：20190816，天津康源生物技术有限公司）；
转染试剂jetPRIME（货号：25Y1801N5，Polyplus-transfection 公司）；
HIV-1 p24抗原定量检测试剂盒（货号：K12P2401，北京科跃中楷生物技术有限公司）；
Bright-LumiTM Ⅱ萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：082521211008，碧云天生物技术有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 埃博拉突变体GP 表达质粒构建 T544ID552N、A82V-I584L、R29K-A82V、A82V-T206M 突变体为overlap PCR 合成。以A82V 和D552N-T544I质粒为模板，通过2 对（p-up+p2 和p-down+p1）引物扩增含有突变位点的2 个片段（PCR 引物见表1）。扩增条件：94 ℃ 3 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30 个循环；
72 ℃ 5 min。胶回收对应产物，分别取200 ng 不加任何引物先扩增3 个循环。再加引物p-up 和p-down 进行扩增，胶回收2 kb 大小扩增产物，产物经酶切过夜，克隆GP表达载体pcDNA3.1。
表1 突变株引物Tab.1 Mutant strain primers
1.2.2 假病毒制备 接种HEK293T 于10 cm 细胞培养皿，待细胞密度达到60%～80%时按照jetPRIME转染试剂说明书，将GP 或突变体GP-pcDNA3.1 表达质粒与pSG3.ΔEnv.CMV.Fluc 质粒按照1∶4 的比例共转染HEK293T 细胞，48 h 后取培养上清。4 ℃下3 000 r/min 离心10 min，上清经0.45 µm 滤膜过滤，分装冻存于-80 ℃。
1.2.3 假病毒定量及鉴定 将25 µl生物素标记的多克隆抗体加入到预先包被p24单克隆抗体的酶标板，随后加入500、5 000 倍稀释的假病毒样品以及校准品（75 µl/孔），37 ℃孵育1 h。洗板后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（HRP-SA），37 ℃孵育30 min，最后加入HRP 底物显色液进行显色，测定OD450。根据校准品做标准曲线并计算假病毒原液的p24抗原浓度，按照该浓度对突变体进行定量。按照定量结果将EBOV GP 和VSV 假病毒的上清感染293T 细胞，36 h 后收取细胞上清，将VSV 假病毒感染的细胞作为对照，假病毒中的p24 作为内参。在收取的细胞上清中加5×Loading Buffer，沸水浴 10 min。采用12%的预制胶进行SDS-PAGE 凝胶电泳，室温恒压160 V，蛋白分离后转至PVDF 膜。采用5%脱脂牛奶室温封闭置于摇床1 h，再采用5%的牛奶孵育mAb114 和p24 抗体4 ℃过夜。TBST 洗膜3 次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h。TBST洗膜3遍后ECL显影。
1.2.4 假病毒感染细胞实验 将假病毒用无血清的DMEM 按照p24 定量结果标准化进行稀释，保证各突变体投入病毒量一致。设置复孔，分别感染HEK293T、Huh7、A549 和THP-1 细胞。向96 孔板中加入HEK293T、Huh7、A549、THP-1细胞3×104个/孔，假病毒和细胞各100 µl/孔，设置未加假病毒的孔为阴性对照。置于37 ℃细胞培养箱孵育36 h后，每孔弃去100 µl上清，加入100 µl萤火虫荧光素酶底物，避光反应5 min 后测荧光素酶活性。将测出的结果中母本EBOV的发光值比作1，计算各突变体感染值的倍数变化。
1.2.5 抗体中和实验 采用无血清的DMEM 将假病毒进行40 倍稀释、抗体稀释为高、中、低3 个浓度，同时设置未加抗体组。将稀释的假病毒（50 µl）与相应浓度的抗体（50 µl）加入96 孔板，预先置于37 ℃细胞培养箱中孵育1 h，再加入3×104个/孔HEK293T 细胞，终体系200 µl。置于37 ℃培养箱孵育36 h后，每孔弃去100 µl上清，加入100 µl萤火虫荧光素酶底物，避光反应5 min 后测荧光素酶活性。计算抑制率，抑制率（%）=(未加抗体组发光强度-样品组发光强度)/未加抗体组发光强度×100%。
1.3 统计学分析 实验数据采用SPSS25.0 软件处理分析，数据表示为±s，两组间比较采用t检验分析，使用GraphPad Prism 8.0 软件作图并分析实验结果。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.1 埃博拉突变体GP 表达质粒的构建 Overlap PCR 产物经BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点克隆于载体pcDNA3.1，琼脂糖凝胶电泳酶切鉴定显示正确插入（图1），GP 大小约为2 000 bp，pcDNA3.1 大小为 5 428 bp。利用通用引物BGH-R 或T7 引物进行测序，测序结果显示突变体质粒构建成功。
图1 埃博拉突变体经BamHⅠ/XbaⅠ双酶切鉴定Fig.1 EBOV was identified by BamHⅠ/XbaⅠ
2.2 假病毒制备及鉴定 为了进一步验证收取的上清为含有EBOV GP 的假病毒，采用特异的抗GP单抗mAb114 和p24 抗体进行Western blot 检测，结果显示：上清中可检测到EBOV GP 约为150 kD，p24大小约为25 kD（图2），证实GP 表达质粒与pSG3.ΔEnv.CMV.Fluc 共转染HEK293T 细胞后成功包装出埃博拉假病毒。
图2 Western blot检测EBOV GP表达Fig.2 Detection of EBOV GP expression by Western blot
2.3 EBOV 及其突变体假病毒感染细胞实验 将含有EBOV 的假病毒上清10 倍稀释后，感染HEK293T、Huh7、A549细胞，36 h后进行荧光素酶检测，结果显示，埃博拉假病毒对3个细胞系均具有感染力（图3）。
图3 EBOV 假 病 毒 和pSG3. ΔEnv. CMV. Fluc 感 染 的HEK293T、Huh7和A549细胞荧光素酶活性Fig.3 Luciferase activity of EBOV pseudovirus and HEK293T，Huh7 and A549 cells infected by pSG3.ΔEnv.CMV.Fluc
经EBOV 及突变体假病毒p24 含量测定和 EBOV GP与p24比例进行GP定量后，将突变体假病毒的GP 含量调整为一致，分别感染HEK293T、Huh7、A549和THP-1细胞。实验发现多点联合突变增强了病毒进入宿主细胞的效率，突变体较母本感染力增强，且在不同细胞系呈现不同感染力。假病毒感染HEK293T 细胞的感染力较母本增强2 倍及以上的有T544I、D552N、A82V-T544I、T544I-D552N、A82V-D552N、A82V-T544I-D552N、A82V-I371V、A82VI584L、A82V-P202L-L239S（图4A）。在Huh7 细胞中感染力较母本增强2 倍及以上的有T5440I、D552N、A82V-T544I、T544I-D552N、A82V-D552N、A82VT544I-D552N、A82V-T230A、A82V-I371V、A82VI584L、R29K-A82V（图4B）。在A549 和THP-1 细胞上的感染值较HEK293T 和Huh7 细胞低，感染力增强2 倍 的 分 别 为T544I、A82V-T544I、A82V-T544ID552N、A82V-I371V、A82V-I584L、A82V-T206M 和D552N、A82V-T544I、A82V-D552N、A82V-T544ID552N、A82V-I371V（图4C、4D）。对原代NK 细胞、Jurkat 和Raji 细胞进行了评价，结果显示，感染值较低且突变株和母本间感染性差异不明显。
图4 EBOV及突变体假病毒感染细胞的倍数变化Fig.4 Fold change of EBOV and mutants pseudovirus infected cells
2.4 抗体中和实验 为了检测EBOV 突变是否导致抗体逃逸，对3 株单抗mAb114、ADI-15946、rEBOV-520的中和活性进行评价，结果显示，相比于母本，rEBOV-520 对大多数天然及传代所致的高侵袭性突变体均有中和活性，且具有量效关系。然而，rEBOV-520 对3 株 突 变 体（A82V-T544I-D552N、A82V-T230A、N107D-P330S-G480D）的中和作用减弱，尤其是对N107D-P330S-G480D 突变体中和作用显著降低（图5A）。ADI-15946 对4 株突变体（T544I、A82V-T230A、A82V-I371V、A82V-I584L）的中和作用减弱（图5B）。然而，mAb114 不仅对所有被检测的突变体中和作用没有减弱，且对多个突变体（A82V、A82V-T544I、A82V-D552N、A82V-T544ID552N）的中和作用显著增强，提示mAb114 可能是用于防治未来潜在的突变体感染较好的抗体药物。
图5 rEBOV-520、ADI-15946、mAb114中和EBOV及突变体假病毒Fig.5 rEBOV-520，ADI-15946，mAb114 neutralize EBOV and mutants pseudovirus
本文基于含萤火虫荧光素酶报告基因的EBOV假病毒系统，在不同细胞系中比较了EBOV 假病毒母本及突变体的感染力。发现在肝和肾细胞系中突变体感染力均呈不同程度增强。有研究报道，突变株（A82V、T544I）与母本EBOV 相比GP 融合前构象稳定性降低，因此通过降低宿主因子组织蛋白酶B 和Niemann-Pick C1（NPC1）触发的膜融合活性阈值而增强感染［29-31］。随后采用3 株靶向单抗进行功能评价，其中突变体N107D-P330S-G480D 中和作用显著降低，原因可能是EBOV GP 的104、106、107、545-547、549位是rEBOV-520结合位点，该突变体的107 位突变导致抗体结合能力大大降低［22］。ADI-15946 对T544I、A82V-T230A、A82V-I371V、A82VI584L 的中和作用减弱，可能的原因是ADI-15946结合位点位于GP2，使抗体和突变株的结合受到影响［23］。而mAb114 对所有被检测的突变体中和作用没有减弱，且对多个突变体中和作用显著增强的原因可能是A82V 位于受体结合区（RBD），RBD 高度保守，是mAb114 与GP 的结合位点［18］。因此推测突变发生在抗体表位附近时，抗体中和作用会受影响导致中和作用降低甚至失效，以此可根据抗体表位预测其对突变体的中和是否仍有效，这一推测需要后续更多的数据进行验证。
由于EBOV 的致死率较高，且引发大规模流行的疫情频次较低，目前，在感染人群中检测到的突变有限。本文研究的14 株突变体包含了一些文献报道的在细胞培养过程中筛选出的突变（T544I、D552N、I584L），后续如果有新的突变，可以用该评价体系快速对其感染性进行检测。本文的另一局限是对这些突变体仅进行了3 株抗体的评价，其他抗体对突变株的作用有待进一步研究，且本文的体外评价数据仍有待在体内实验中选取真病毒进行验证。由于病毒在传播中易产生突变，突变株能够避开免疫系统的攻击，突变后使现有的抗体失效，可以考虑多个单抗联合使用弥补单一抗体作用不足，实现“1+1＞2”的效果。
EBOV 的高危性和暴发的不可预测性使丝状病毒成为生物防御的研究重点，目前候选药物中最有前景的方法之一是注射靶向EBOV GP 的单抗［32］。2020 年FDA 批准了两种靶向GP 的单抗药物InmazebTM（REGN-EB3）和EbangaTM（mAb114）［33］，但这些单抗仅对EBOV 有效，SUDV 和BDBV 的治疗药物仍有待探索。
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