张爱建 秦红艳 郑宝寿 王剑华 （大理大学第一附属医院泌尿外科，大理 671000）
前列腺癌（prostate cancer， PCa）是男性常见的恶性肿瘤之一，严重威胁患者的健康［1-2］。铁死亡是一种新的受调控的细胞死亡形式，其特征在于细胞内亚铁离子（Fe2+）的产生、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）的失活［3］。GPX4 在铁死亡中起关键作用，是铁死亡的抑制剂。据报道，GPX4 在PCa 中呈高表达，下调其表达可诱导PCa 细胞 铁 死 亡［4］。故GPX4 是PCa 的 重 要 调 控 靶 点。miR-214-3p 是一种在癌症中被广泛研究的抑制性miRNA，在PCa 组织中表达下调，也是PCa 肿瘤发生的关键调节因子［5］。研究显示，GPX4 是miR-214-3p的直接靶标［6-7］。然而，PCa 中GPX4 高表达是否与miR-214-3p表达降低有关尚未明确。
环状RNA（circRNA）在包括PCa 在内的肿瘤发生中发挥关键作用［8］。最近的一项研究显示，circ-ZMIZ1 在PCa 患者中呈高表达，参与了PCa 的发生和发展；
敲低circZMIZ1 可抑制PCa 细胞增殖［9］。通过生物信息学预测网站预测circZMIZ1 可能吸附的miRNA，发现miR-214-3p 是circZMIZ1 的候选靶标之一。circZMIZ1 是否可通过与miR-214-3p 相互作用调节PCa 细胞的铁死亡仍不清楚。因此，本研究旨 在 探 讨PCa 细 胞 中circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4之间的相互作用和功能关联。
1.1 材料
1.1.1 细胞与实验动物 20 只雄性BALB/c 裸鼠（4周龄，体质量20 g）购自济南朋悦实验动物繁育有限公司［许可证号：SCXK（鲁）20190003］，并饲养在特定的无病原体环境中。人正常前列腺上皮细胞（RWPE-1）购自美国ATCC 细胞库（EY-X0718）；
PCa细胞系（22Rv1、VCaP、PC3 和DU145）购自武汉普诺赛生命科技有限公司（CL-0004、CL-0241、CL-0185、CL-0075）；
所有细胞于37 ℃和5%CO2条件下在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素G和100 µg/ml链霉素的RPMI1640 培养基中培养。慢病毒载体由上海GenePharma公司构建。
1.1.2 主要试剂与仪器 靶向circZMIZ1 的小分子干扰RNA（si-circZMIZ1）、miR-214-3p mimic、miR-214-3p inhibitor 及其阴性对照（si-NC、miR-NC、inhibitor-NC）由广州Ribobio 设计和合成；
MTT 细胞增殖检测试剂盒（M1020）、膜联蛋白V（Annexin-V）- FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（CA1020）购自北京Solarbio 公司；
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）（A020-1-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（A003-1-2）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）（A006-2-1）检测试剂盒购自南京建成生物技术研究所；
Fe2+检测试剂盒（E-BC-K304-S）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；
ROS 检测试剂盒（YT290）购自北京百奥莱博科技有限公司；
Magna RIP 试剂盒（17-700）购自Millipore；
兔抗人GPX4抗体（ab125066）购自英国Abcam公司；
ABI Prism®7500型荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems 公司；
FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD Biosciences 公司；
IX53/DP80 荧光显微镜购自日本Olympus 公司；
生物素标记的野生型或突变型miR-214-3p（Biotin-miR-214-3p-WT 或Biotin-miR-214-3p-MUT）探针由广州Ribo-Bio合成。
1.2 方法
1.2.1 qRT-PCR 检测细胞circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4 表达 使用Trizol 试剂从RWPE-1 细胞和PCa 细胞中提取总RNA，使用cDNA 合成试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA，随后在ABI Prism®7500 型荧光定量PCR 仪上使用SYBR Green Super Mix 试剂盒进行PCR 扩增。热循环条件如下：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s 的40 个循环。引物序列见表1。GAPDH 为circZMIZ1 和GPX4 mRNA表达水平标准化的内部对照，U6为miR-214-3p表达水平标准化的内部对照，使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。
表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers
1.2.2 Western blot 检测细胞GPX4 蛋白表达 使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液提取RWPE-1 细胞和PCa 细胞总蛋白，BCA 蛋白测定试剂测定蛋白浓度。SDS-PAGE 凝胶电泳分离等量蛋白样品（40 µg）并转移到聚偏二氟乙烯膜。将膜用5%脱脂牛奶封闭1 h 后，与一抗GPX4 和GAPDH （1∶1 000）在4 ℃下孵育过夜，然后将膜与适当的HRP偶联二抗在室温下孵育1 h。通过电化学发光试剂观察免疫反应条带。Image J 软件测定蛋白条带的灰度值，目的蛋白与GAPDH 灰度值的比值用于统计分析。
1.2.3 双荧光素酶报告基因检测 使用StarBase数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）预测miR-214-3p 与circZMIZ1 和GPX4 之间的结合位点。circZMIZ1 和GPX4 mRNA 的部分序列（包含与miR-214-3p 的互补结合位点）通过PCR 扩增并克隆到pmirGLO 载体中，这些野生型报告质粒被称为WT-circZMIZ1 和WT-GPX4。此外，将circZMIZ1 和GPX4 mRNA 中的突变序列构建到pmirGLO 载体中以产生MUT-circZMIZ1 和MUT-GPX4。对于荧光素酶活性测定，将PC3 细胞以1×105个/孔的密度接种至24孔板，使用Lipofectamine 3000将这些荧光素酶重组质粒与miR-214-3p mimic 或对照（miR-NC）共转染至PC3 细胞。37 ℃、5%CO2条件下培养48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫荧光素酶活性，并将其标准化为海肾荧光素酶活性。
1.2.4 RNA pull-down 分析 将PC3 细胞在含有RNase 抑制剂的裂解缓冲液中裂解。将细胞裂解物（2 µg）与100 pmol Biotin-miR-214-3p-WT 或BiotinmiR-214-3p-MUT 共同孵育2 h。将链霉亲和素琼脂糖珠加入反应体系中，室温孵育1 h。随后，在裂解缓冲液中洗涤糖珠，与糖珠结合的RNA 被捕获并用Trizol提取，应用qRT-PCR检测circZMIZ1水平。
1.2.5 RNA 结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）检测 采用含有RNase抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞。将含有Argonaute-2抗体（Ago2）或免疫球蛋白G 抗体（IgG）的琼脂糖珠与细胞裂解物在4 ℃下孵育过夜。然后，将糖珠洗涤并与蛋白酶K 共同孵育以去除蛋白质。最后，提取免疫沉淀的RNA，并通过qRT-PCR 检测circ-ZMIZ1和miR-214-3p的富集。
1.2.6 细胞转染 将PC3 细胞接种至6 孔板（1×105个/孔）并培养过夜。使用Lipofectamine 3000 试剂 将si-NC、si-circZMIZ1、inhibitor-NC、miR-214-3p inhibitor 转染到细胞中。实验分为：对照组（NC 组，无转染）、si-NC 组（转染si-circZMIZ1 阴性对照si-NC）、si-circZMIZ1 组（转染si-circZMIZ1）、si-circ-ZMIZ1+anti-NC 组（si-circZMIZ1 和miR-214-3p inhibitor 阴性对照inhibitor-NC 共转染）、si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组（si-circZMIZ1 和miR-214-3p inhibitor 共转染）。转染6 h，继续培养48 h 后，收集细胞，qRT-PCR 检测细胞中circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 mRNA 的表达水平，并采用Western blot 检测细胞中GPX4蛋白表达。
1.2.7 MTT 法检测细胞增殖活性 将转染48 h 后的各组PC3细胞以5×103个/孔接种至96孔板。培养24 h、48 h 和72 h 后，向培养基中加入10 µl MTT 溶液（5 mg/ml），置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h。随后，以100 µl/孔加入DMSO 溶解甲臜产物。采用酶标仪检测570 nm处的吸光度值。
1.2.8 LDH 活性检测 在6 孔板的每孔中接种 1×105个细胞，转染48 h 后，收集细胞培养上清液并与反应混合物混合。孵育30 min 后，在440 nm 处测量吸光度（A）评估LDH水平。
1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡 将转染48 h 后的细胞用胰蛋白酶化消化、离心并重悬于500 µl 1×结合缓冲液中（5×105个），将细胞在黑暗中采用 5 µl Annexin-V-FITC 和5 µl PI 染色15 min 后，通过流式细胞术分析细胞凋亡。细胞凋亡率为细胞早期凋亡（Annexin V+PI-）和晚期凋亡（Annexin V+PI-）的百分比总和。
1.2.10 Fe2+含量和MDA、GSH水平测定 使用Fe2+检测试剂盒测定细胞内Fe2+水平。收集转染48 h 后的各组细胞并采用PBS 洗涤2 次，随后采用细胞裂解液裂解细胞。在4 ℃下以13 000 g离心10 min，弃去沉淀物，收集上清液。将上清液与铁还原剂在室温下孵育30 min 后，与铁探针混合并在室温下孵育1 h。使用酶标仪在593 nm 波长处测量吸光度，绘制标准曲线并计算Fe2+浓度。应用MDA、GSH 测定试剂盒检测上清液中MDA含量和细胞内GSH水平。
1.2.11 ROS 活性测定 将细胞接种至6 孔板，转染培养48 h 后，除去原培养基，将细胞在培养箱中用含10 µmol/L DCFH-DA 染料的新鲜培养基在37 ℃下避光染色30 min。收集细胞，洗涤并悬浮在PBS中，使用荧光显微镜进行观察。
1.2.12 裸鼠成瘤实验 20只雄性BALB/c裸鼠分为si-NC 组、si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组和si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p组（每组5只）。si-circ-ZMIZ1、miR-214-3p inhibitor 或si-NC、inhibitor-NC 分别通过慢病毒载体转染PC3细胞获得稳定表达。随后，BALB/c 裸鼠皮下注射转染后的PC3 细胞悬液（2×106个/200 µl）。接种后每周使用游标卡尺评估肿瘤体积（V=1/2×a×b2，a：肿瘤长度；
b：肿瘤宽度）；
4 周后，处死裸鼠，收获肿瘤组织，立即测量肿瘤重量。将肿瘤组织分为两部分，一部分用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋，用于免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色；
另一部分-80 ℃冰箱保存，采用qRT-PCR检测circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4的表达。
1.2.13 IHC 染 色 检 测肿瘤组织Ki-67 和GPX4 的表达 取4%多聚甲醛固定的肿瘤组织，石蜡包埋， 切成4 µm 切片。将切片在4 ℃下与一抗Ki-67 （1∶100）和GPX4（1∶100）共同孵育过夜。然后，加入二抗（1∶200）在室温下孵育30 min。DAB显色，苏木精复染1 min。封片，在光学显微镜下观察Ki-67和GPX4 的阳性表达，并用Image-Pro Plus 6.0 软件计算平均光密度（mean optical density，MOD）。
1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析。计量资料以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2.1 circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 在PCa 细胞中的表达水平 与RWPE-1 细胞相比，PCa 细胞系（22Rv1、VCaP、PC3 和DU145）中circZMIZ1、GPX4 mRNA和GPX4蛋白水平显著升高，miR-214-3p水平显著降低（P＜0.05）；
其中，PC3 细胞中circZMIZ1、GPX4 mRNA 和GPX4 蛋白水平明显高于其他细胞系，miR-214-3p 水平明显低于其他细胞系，故选择PC3细胞进行后续实验。见图1。
图1 不同PCa 细胞中circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 水平比较Fig.1 Comparison of circZMIZ1， miR-214-3p and GPX4 levels in different PCa cells
2.2 circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 的调控关系验证 StarBase数据库预测了circZMIZ1和miR-214-3p的靶向结合序列（图2A）。双荧光素酶检测结果显示，与转染miR-NC 相比，转染miR-214-3p mimic后，含有WT-circZMIZ1 质粒细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），而含有MUT-circZMIZ1 质粒细胞的荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05，图2B）。RNA pull-down 结果显示，circZMIZ1 被生物素标记的miR-214-3p（Biotin-miR-214-3p-WT）拉下，而不是突变体Biotin-miR-214-3p-MUT（图2C）。RIP测定结果显示，相对于IgG 对照组，circZMIZ1 和miR-214-3p在Ago2 免疫沉淀中显著富集（P＜0.05，图2D）。此外，StarBase 数据库预测显示GPX4 的3"UTR 包含miR-214-3p 的可能结合位点（图2E）。双荧光素酶检测结果显示，与转染miR-NC 相比，转染miR-214-3p mimic 后，含有WT-GPX4 质粒细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），而含有MUT-GPX4 质粒细胞的荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05，图2F）。qRTPCR 和Western blot 结果显示，与NC 组相比，si-circ-ZMIZ1 组circZMIZ1、GPX4 mRNA 和GPX4 蛋白水平显著降低，miR-214-3p 水平显著升高（P＜0.05）；
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组GPX4 mRNA 和GPX4 蛋白水平显著升高，miR-214-3p 水平显著降低（P＜0.05，图2G～K）。
图2 circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4的调控关系验证Fig.2 Verification of regulatory relationship of circ-ZMIZ1， miR-214-3p and GPX4
2.3 敲低circZMIZ1对PC3细胞的影响 MTT结果显示，在48 h、72 h 时，与NC 组相比，si-circZMIZ1 组PC3 细胞增殖活性显著降低（P＜0.05）；
与si-circ-ZMIZ1组、si-circZMIZ1+anti-NC组相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组PC3 细胞增殖活性显著升高（P＜0.05，图3A）。与NC 组相比，si-circZMIZ1 组PC3 细胞培养上清液中LDH 水平显著升高（P＜0.05）；
与si-circZMIZ1组、si-circZMIZ1+anti-NC组相比，si-circ-ZMIZ1+anti-miR-214-3p 组LDH 水平显著降低（P＜0.05，图3B）。流式细胞术结果显示，与NC 组相比，si-circZMIZ1组PC3细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比，sicircZMIZ1+anti-miR-214-3p 组细胞凋亡率显著降低（P＜0.05，图3C、3D）。此外，与NC 组相比，si-circ-ZMIZ1 组Fe2+含量和MDA、ROS 水平显著升高，GSH水平显著降低（P＜0.05）；
与si-circZMIZ1 组、si-circ-ZMIZ1+anti-NC 组相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组Fe2+含量和MDA、ROS 水平显著降低，GSH 水平显著升高（P＜0.05，图3E～I）。
图3 敲低circZMIZ1对PC3细胞的影响Fig.3 Effect of circZMIZ1 knockdown on PC3 cells
2.4 敲低circZMIZ1 对裸鼠移植瘤生长的影响 与si-NC 组相比，si-circZMIZ1 组肿瘤体积和重量显著降低（P＜0.05）；
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组肿瘤体积和重量显著升高（P＜0.05，图4A、4B）。免疫组织化学染色结果显示，与si-NC 组相比，si-circ-ZMIZ1 组肿瘤组织中Ki-67 和GPX4 阳性表达显著降低（P＜0.05）；
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组肿瘤组织中Ki-67 和GPX4 阳性表达显著升高（P＜0.05，图4C、4D）。qRT-PCR结果显示，与si-NC组相比，sicircZMIZ1 组肿瘤组织中circZMIZ1 和GPX4 mRNA水平显著降低，miR-214-3p 水平显著升高（P＜0.05）；
与si-circZMIZ1 组、si-circZMIZ1+anti-NC 组相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 组肿瘤组织中GPX4 mRNA水平显著升高，miR-214-3p水平显著降低（P＜0.05，图4E）。
图4 敲低circZMIZ1对裸鼠移植瘤生长的影响Fig.4 Effect of circZMIZ1 knockdown on tumor growth in nude mice
铁死亡是一种细胞死亡形式，其特征在于细胞中铁依赖性脂质过氧化物的积累。引发铁死亡已成为一种有前途的癌症治疗策略，包括PCa［4，10］。circRNA 是通过选择性剪接从其亲本线性RNA衍生而来的闭合环状RNA。由于其高稳定性和对RNase的抗性，circRNA 成为早期诊断和治疗多种癌症的理想生物标志物。最近的研究表明，circRNA 可调节肿瘤细胞中的铁死亡［11］。据报道，circZMIZ1 在PCa 中上调，敲低其表达可抑制PCa 细胞增殖并导致细胞周期停滞［9］。在本研究中，circZMIZ1 在PCa细胞系中的表达明显高于人正常前列腺上皮细胞，敲低circZMIZ1 可降低PCa 细胞活力和体内肿瘤生长，并诱导PCa 细胞凋亡，与既往研究一致。表明circZMIZ1 可能在PCa 进展中发挥重要作用，但其对PCa铁死亡的作用仍不清楚。
circRNA 通过作为miRNA 海绵调控miRNA 介导的靶mRNA 表达［12］。为了研究circZMIZ1 介导的PCa 发生发展的潜在机制，通过生物信息学数据库探索了circZMIZ1 介导的竞争性内源性RNA 网络，发现miR-214-3p 是circZMIZ1 的候选靶标之一。miR-214-3p 已被证实是PCa 的肿瘤抑制因子［5］。与既往的研究一致，在本研究中miR-214-3p 在PCa 细胞系中呈低表达。由于miR-214-3p 与circZMIZ1 在PCa 中的表达趋势相反及其在多种癌症中的抑癌作用，因此选择miR-214-3p 进行进一步实验。通过双荧光素酶报告基因分析、RNA pull-down 实验和RIP实验证实miR-214-3p 与circZMIZ1 在PCa 细胞中的直接靶标相互作用。随后，通过使用qRT-PCR 分析circZMIZ1 敲低对miR-214-3p 的影响，结果显示， circZMIZ1 敲低可升高miR-214-3p 表达，且下调miR-214-3p 可明显减弱circZMIZ1 敲低对PCa 细胞增殖和体内移植瘤生长的抑制作用和凋亡的促进作用。提示，circZMIZ1通过海绵化下调miR-214-3p表达促进PCa进展。
此外，GPX4 是miR-214-3p 的靶标。HE 等［6］的研究显示，上调miR-214-3p 可抑制GPX4 表达，进而抑制肝癌细胞的活力并诱导铁死亡。在本研究中，生物信息学分析揭示了miR-214-3p 与GPX4 mRNA的3"UTR 之间的潜在相互作用，双荧光素酶报告基因测定随后验证了miR-214-3p 和GPX4 在PCa 细胞中的直接相互作用。qRT-PCR 和Western blot 检测人PCa 细胞系中GPX4 的表达，发现GPX4 的mRNA和蛋白水平在PCa 细胞中呈高表达，与PCa 中miR-214-3p的表达趋势相反，与circZMIZ1的表达趋势一致。作为铁死亡的关键抑制剂，GPX4 与GSH 相互作用以减少生物膜内的过氧化物酶反应，从而抑制脂质ROS 的积累和铁死亡的激活［13］。铁死亡诱导的细胞膜结构破坏可导致细胞外释放LDH。在本研究中，细胞死亡生物标志物LDH 水平升高证实了circZMIZ1 敲低后诱导的细胞铁死亡。铁死亡的独特生化特征包括积累的亚铁和脂质ROS。因此，本研究评估了Fe2+、ROS 和脂质过氧化MDA 的积累，结果显示，circZMIZ1 敲低在上调miR-214-3p 表达，降低GPX4 表达的同时增加了Fe2+和MDA、ROS 的产生，降低了GSH 水平；
且下调miR-214-3p 可明显升高GPX4 表达，降低了circZMIZ1 敲低诱导的铁沉积和ROS、MDA 水平。以上提示，circZMIZ1 敲低可能通过miR-214-3p/GPX4 轴在PCa 细胞中引发铁死亡。
综上所述，敲低circZMIZ1 可能通过miR-214-3p/GPX4 轴诱导PCa 细胞铁死亡。本研究结果将为PCa 的治疗提供新的见解和靶点。但本研究仅评估了一种PCa 细胞系，在未来的研究中将采用其他PCa细胞系进行验证。
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