李芳婵，韦志英，罗小莉，潘翠柳，吴秀彩，梁方耀，潘真真*，李耀华*（1.广西中医药大学教学实验实训中心，南宁 50200；
2. 广西高校中药提取纯化与质量分析重点实验室，南宁 50200；
. 广西中医药大学药学院，南宁 50200）
目前，乳腺癌约占女性癌症病例的24.5%，占癌症死亡的15.5%，发病率和病死率均居首位，已经成为严重威胁女性健康的恶性肿瘤[1]，随着生活水平日益提高、环境污染和人口老年化的加剧，预计2070年新发乳腺癌病例将达到440万[2]。在我国乳腺癌每年新发病例约27.9万，并以每年2%的速度递增[3]。乳腺癌的主流治疗方案一般以化学治疗为主，配合手术切除和放射治疗的综合治疗，化疗药物大多是小分子细胞毒性药物，虽然能杀伤肿瘤细胞，但选择性和靶向性差，会对人体正常的组织细胞实行“无差别攻击”，使患者出现严重的毒副作用，化疗后期患者的生存质量差，以至于化疗难以持续，在临床中的应用有很多局限性[4-5]。因此，探索更好的化学治疗方案，提高乳腺癌治疗水平具有深远的理论和现实意义。
姜黄素（curcumin，CUR）是从姜黄根茎中提取的一种脂溶性多酚，具有抗肿瘤、抗菌、抗抑郁、抗炎、抗氧化等多种药理活性[6-9]。CUR的抗肿瘤作用，在近几年受到国内外的广泛关注，文献报道其通过调节如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核转录因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）及环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）等促炎因子和细胞因子的表达水平而抑制肿瘤细胞的增殖[10-12]。但因CUR为脂溶性多酚，难溶于水，口服给药吸收差，在普通给药方式下CUR的生物利用率很低，限制其临床应用。阿霉素（doxorubicin，DOX）是临床一线广谱抗肿瘤药物，通过激发拓扑异构酶Ⅱ裂解DNA从而破坏DNA的三级结构，并触发细胞凋亡途径，是临床治疗乳腺癌的化疗药物之一[13-14]。但是，DOX选择性较差，临床应用时出现明显的毒副作用，对心、肝、肾等正常组织和器官造成损伤，长期使用会引起患者强烈的过敏反应、心脏毒性和肝脏损伤[15-17]。联合用药是肿瘤治疗的新方向之一，将不同作用机制的抗肿瘤药物联合起来，降低肿瘤对化疗药物的耐药性，增强化疗药物对肿瘤的杀伤作用[18-20]。多项研究表明，CUR与DOX联用，增强了DOX的抗肿瘤作用，降低了DOX的给药剂量，从而降低DOX的毒副作用[21]。体外研究发现CUR和DOX联合给药，能够有效提高乳腺癌细胞MCF-7和MDAMB-231对DOX的敏感性，降低DOX的半数抑制浓度（IC50）[22]。另一研究发现，在DOX耐药细胞中，CUR和DOX联合给药能有效抑制ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白家族中的外排蛋白ABCB4的活性，从而逆转乳腺癌细胞的DOX耐药[23]。此外，多项研究发现CUR能降低DOX诱导的心脏毒性。有研究揭示CUR可能是通过消除大鼠的炎症、凋亡、改善DNA氧化损伤和调节蛋白质氧化水平来改善DOX诱导的心脏毒性[24]。另有研究发现，与单用DOX给药的小鼠组相比，DOX和CUR联合给药组的小鼠血清心肌酶显著降低，抗氧化能力提高；
进一步研究发现CUR通过 PI3K/Akt/mTOR通路抑制DOX诱导的心肌细胞焦亡[25]。因此，研究DOX和CUR联合用药具有理论和现实意义。
本研究以三嵌段共聚物聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯（PCL-PEG-PCL）为载体，采用薄膜-水化-超声法制备共载姜黄素/阿霉素胶束（CUR/DOX micelle）。以粒径、包封率和载药量为考察指标，单因素结合正交实验对CUR/DOX micelle制备工艺进行优化，确定其最优制备工艺条件。对CUR/DOX micelle进行表征，并考察其体外细胞摄取率和抗肿瘤活性。本研究通过制备胶束实现共载姜黄素与阿霉素，采用联合给药模式发挥协同抗肿瘤作用，为肿瘤治疗提供新的思路。
1.1 仪器
旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；
JY92-2D超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；
LC2030高效液相色谱仪、RF-6000荧光分光光度计（日本岛津仪器有限公司）；
EM10透射电子显微镜（德国蔡司公司）；
纳米粒度分析仪（美国麦奇克有限公司）；
FreeZone 2.5冷冻干燥仪（美国Labconco公司）；
CT 15RE冷冻离心机（日本日立公司）；
Multiskan Sky型酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；
LSR Fortessa流式细胞仪（BD公司）。
1.2 试药
姜黄素原料药（北京百灵威科技有限公司，批号：921105）；
姜黄素对照品（纯度：99.50%，成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-21022710）；
阿霉素（大连美仑生物技术有限公司，对其进行脱盐处理）；
PCL8000-PEG6000-PCL8000（山东岱罡生物科技有限公司）；
甲基偶氮唑盐（MTT，北京索莱宝科技有限公司，批号：829Z0513）；
人乳腺癌细胞MCF-7（中国科学院上海细胞生物学研究所）；
胎牛血清（美国Gemini，批号：A87F82H）；
1640培养基（赛默飞世尔科技有限公司，批号：8120133）；
磷酸缓冲盐（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20211210）；
其他试剂均为分析纯。
2.1 CUR/DOX micelle的制备
采用薄膜-水化-超声法制备CUR/DOX micelle。称取处方量的CUR、脱盐DOX（CUR∶DOX＝5∶1）和PCL-PEG-PCL，加入适量的二氯甲烷-丙酮混合溶液（1∶1）使其溶解后，减压旋转蒸发除去有机溶剂，直至在瓶底形成一层橘红色的薄膜。加入适量去离子水，水浴加热水化。水化后于冰浴中探头超声处理（250 W），过0.22 μm微孔滤膜除去游离CUR和DOX，即得。同法制备不含药的空白胶束、单载CUR胶束和单载DOX胶束。
2.2 CUR和DOX的含量测定
采用高效液相色谱法对CUR进行含量测定。色谱条件：流动相为甲醇-4%冰醋酸（48∶52），色谱柱为Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 µm），检测波长为430 nm，柱温30℃；
流速1 mL·min-1；
进样量10 µL。经方法学验证表明方法的专属性良好；
回归方程为Y＝7.79×104X-5.95×103，r＝0.9999（n＝5），CUR在21.30～106.50 μg·mL-1内与峰面积线性关系良好。精密度和重复性RSD分别为1.8%、2.1%（n＝6）；
平均加样回收率为99.17%，RSD为1.4%。
采用荧光分光光度法对DOX含量进行测定（避光操作），激发波长为485 nm，发射波长为590 nm，测定其荧光强度。回归方程为Y＝0.2203X+32.13，r＝0.9999（n＝5），结果表明DOX在400～6400 ng·mL-1内与峰面积线性关系良好。精密度和重复性RSD分别为1.4%、1.0%（n＝6）；
平均加样回收率为99.33%，RSD为2.5%。
2.3 包封率和载药量的测定
按“2.1”项下方法制备CUR/DOX micelle，并且取出部分进行冷冻干燥。采用高速离心法测定其载药量及包封率，称取一定量CUR/DOX micelle，计为WM，加入一定量甲醇超声10 min，超高速离心10 min（35 000 r·min-1），取上清液按“2.2”项下方法分别测定CUR和DOX的含量，计为Ws，投药量记为W总。按载药量及包封率的计算公式，分别计算CUR和DOX的包封率和载药量。
载药量（%）＝WS/WM×100%；
包封率（%）＝WS/W总×100%。
2.4 粒径测定
按“2.1”项下方法制备CUR/DOX micelle，分散在一定量的去离子水中，通过纳米粒粒度仪测定其粒径和多分散系数（PDI），平行测定3次，取其平均值。
2.5 CUR/DOX micelle处方工艺优化
2.5.1 正交实验因素和水平 在前期单因素实验基础上，选取对胶束制备影响较大的因素药物与PCL-PEG-PCL的比例（A）、水化温度（B）、超声时间（C）为考察因素，每个因素设定3个水平，以粒径、CUR和DOX的平均包封率和平均载药量为评价指标。按照正交实验设计表L9（34）设计实验，因素水平表见表1。
表1 因素水平表Tab 1 Factor and level
2.5.2 正交实验优选制备工艺 按照表1的因素和水平进行实验，考察胶束制备过程中药物与PCLPEG-PCL的比例（A）、水化温度（B）、超声时间（C）对CUR/DOX micelle制备工艺的影响，最终测定各实验样品胶束的粒径、包封率和载药量。采用加权评分法分析实验结果，设定胶束粒径的加权系数为0.5，包封率为0.25，载药量的加权系数为0.25，综合评分值＝（粒径最小值/粒径×0.5+平均包封率/平均包封率最大值×0.25+平均载药量/平均载药量最大值×0.25）×100%。
正交实验结果见表2，方差分析结果见表3，最终优选的条件为A2B2C2，即药物与PCL-PEGPCL投料比为1∶10，水化温度为65℃，超声时间为6 min。因此，CUR/DOX micelle的制备工艺为：称取处方量的CUR、DOX（CUR∶DOX＝5∶1）和PCL-PEG-PCL（药物与PCL-PEG-PCL投料比为1∶10），加入适量的二氯甲烷-丙酮混合溶液（1∶1）使其溶解后，减压旋转蒸发除去有机溶剂，直至在瓶底形成一层橘红色的薄膜。加入适量去离子水，65℃水浴加热水化。水化后于冰浴中探头超声处理处理6 min（250 W），过0.22 μm微孔滤膜除去游离CUR和DOX，即得。
表2 正交实验设计及结果(n＝3)Tab 2 Orthogonal test design and results (n＝3)
表3 方差分析结果Tab 3 Variance analysis
2.5.3 处方工艺验证 按照优选工艺制备条件进行3批验证实验，结果图1A显示CUR/DOX micelle的粒径为150.0 nm，PDI为0.0573±0.02，CUR载药量为6.80%，包封率为85.21%，DOX载药量为1.28%，包封率为82.92%。透射电镜（TEM）观察CUR/DOX micelle的形态特征，取少量CUR/DOX micelle滴至水化后的铜网上，静置后滤纸吸干，2%的磷钨酸负染，自然挥干，测定。TEM结果显示CUR/DOX micelle为球形，大小均一，结果见图1B。
2.6 CUR/DOX micelle稳定性考察
将CUR/DOX micelle按体积比1∶1分别分散在去离子水和含10%胎牛血清的水溶液中，于0、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h分别测定其粒径，考察其稳定性，见图1C。结果显示在水溶液中纳米粒的粒径稳定在（151.19±1.23）nm，72 h内粒径RSD为0.81%；
在含10%胎牛血清的水溶液中，纳米粒的粒径稳定在（151.47±1.73）nm，72 h内粒径RSD为1.1%，表明在水溶液及含10%胎牛血清的水溶液中CUR/DOX micelle均具有较好的稳定性。
图1 CUR/DOX micelle的粒径分布（A）、TEM（B）及稳定性（C）Fig 1 Particle size（A），TEM photograph（B）and stability（C）of CUR/DOX micelle
2.7 CUR/DOX micelle的体外释药行为考察
采用透析法考察胶束的体外释药行为，为模拟正常体液环境和肿瘤细胞内环境，选择pH 7.4和pH 5.0的磷酸缓冲液（PBS）作为释放介质，为保障疏水药物CUR和DOX的释放介质加入0.1%的吐温80作为表面活性剂。分别取一定量CUR/DOX micelle置于预处理的透析袋中，两端封口，浸于装有释放介质的装置中，释放温度为37℃，摇床转速为120 r·min-1。定时取样（1、2、4、8、10、12、24、36、48、72、96 h），取样量为1 mL，取样后补加相应的PBS 1 mL。样品按“2.2”项下方法分别测定，计算累积释放率（n＝3）。以时间为横坐标，累积释放率为纵坐标绘制体外释药曲线，结果见图2。由体外释药曲线可知，CUR/DOX micelle表现出较好的缓释作用，在pH 7.4的释放介质中，CUR/DOX micelle中的CUR和DOX释放速率比较慢，24 h时胶束的CUR的累积释放率为49.38%，DOX的累积释放率为40.09%，96 h 时CUR的累积释放率为64.08%，DOX的累积释放率为60.13%，而在pH 5.0的释放介质中，释放速度明显加快，96 h时CUR的累积释放率为84.60%，DOX的累积释放率为85.59%，上述结果表明，释放介质的pH值对CUR/DOX micelle影响较大，这有可能是低pH条件下胶束中脂溶性脱盐DOX和CUR，尤其是脱盐DOX在酸性条件下质子化，溶解度升高，释放加快。CUR/DOX micelle的这种pH 敏感释药行为可以减少DOX在体液循环中的释放，增加其在酸性环境如肿瘤细胞内的释放。
图2 CUR/DOX micelle的体外释药曲线Fig 2 Release profile of CUR/DOX micelle in vitro
2.8 细胞摄取考察
取对数生长期的MCF-7细胞，进行细胞计数并调整细胞密度，以5×104/孔的密度接种于24孔板中，进行摄取实验。实验设置分别设置CUR/DOX micelle组，游离脱盐DOX组，并设空白对照组。给药时弃去原培养基，加入含不同样品及10%胎牛血清的细胞培养基，每孔0.5 mL，确保DOX质量浓度为10 μg·mL-1。共孵育4 h，吸弃培养基，胰酶消化并离心收集细胞，冷PBS充分清洗3次，全程避光操作。最后加入PBS 0.5 mL重悬细胞，于流式细胞仪上检测，测定细胞内的荧光强度，并计算细胞摄取率，结果见图3。可以看出，与空白对照组相比，游离脱盐DOX组和CUR/DOX micelle组中的DOX均能进入细胞，游离DOX的摄取效率为73.9%，而CUR/DOX micelle组的摄取效率为82.1%，与游离脱盐DOX组相比，CUR/DOX micelle组的摄取效率明显提高，表明胶束包裹DOX后能显著提高肿瘤细胞的摄取效果。
图3 CUR/DOX micelle的细胞摄取Fig 3 Cellular uptake of CUR/DOX micelle
2.9 体外抗肿瘤活性评价
取对数生长期的MCF-7细胞，消化收集并调整密度，接种于96孔板中，密度为5×103/孔，继续培养24 h后进行实验。实验设置空白对照组、空白纳米粒组、游离CUR组、游离DOX组、单载CUR micelle组、单载DOX micelle组和CUR/DOX micelle组，CUR最终质量浓度为：0、0.52、1.04、2.08、3.12、4.16、5.20、6.24、8.32、10.40 μg·mL-1，DOX最终质量浓度为：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 μg·mL-1，空白纳米粒组采用培养基按给药组相同体积比例进行稀释（n＝6）。继续培养48 h后，加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL继续孵育4 h，弃去培养液，每孔加0.2 mL二甲基亚砜，震荡仪震荡1 min后，酶标仪490 nm下测定吸光度值（OD），按以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率（%）＝（实验组平均OD值-空白纳米粒组平均OD值）/（空白对照组平均OD值-空白纳米粒组平均OD值）×100%。
实验结果见图4，空白纳米粒组在相应的浓度下对MCF-7细胞的生长无明显毒性及抑制作用，可见载体PCL-PEG-PCL生物相容性较好。游离CUR组、游离DOX组、单载CUR micelle组、单载DOX micelle组和CUR/DOX micelle组均有不同程度的抑制肿瘤细胞生长作用，相较于游离DOX组、单载DOX micelle组和CUR/DOX micelle组，游离CUR组和单载CUR micelle组在相应的给药质量浓度下（0.52～10.40 μg·mL-1）肿瘤细胞生长抑制作用较弱。通过拟合计算可知，游离DOX组的IC50为1.24 μg·mL-1，单载DOX micelle组的IC50为1.02 μg·mL-1，CUR/DOX micelle的IC50为0.79 μg·mL-1（以DOX给药量浓度进行拟合计算），这表明联合应用CUR和DOX增强了药物的抗肿瘤作用。
图4 CUR/DOX micelle的细胞毒性Fig 4 Cytotoxicity test of CUR/DOX micelle
根据人乳腺癌MCF-7细胞在不同浓度的游离CUR、游离DOX和CUR/DOX micelle条件下的存活率，采用CompuSyn软件分析联合药物指数（CI），结果见表4。从CompuSyn结果可知，抑制作用（Fa）为50%时CI值、75%CI值、90%CI值及95%CI值均小于1，表明CUR和DOX联用具有协同作用。当CUR质量浓度大于5.2 μg·mL-1，DOX质量浓度大于1 μg·mL-1时，随着药物浓度和抑制率的增加，CI值逐渐降低，这表明CUR和DOX协同作用逐渐增强。
表4 姜黄素和阿霉素的联合药物指数Tab 4 Combination index of curcumin and doxorubicin
2.10 统计学分析
采用GraphPad Prism 9统计软件进行分析，计量数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
联合用药是目前肿瘤治疗的新方向，中药活性成分与化疗药物的作用靶点不同，两者联用，从机制的互补、作用的协同、不良反应的减轻等方面发挥协同效应，提高治疗效果。纳米制剂的主要优势在于其能够包裹溶解性差、稳定性差的药物并将药物传输至体内不同部位，降低药物的毒副作用。采用纳米技术共载化疗药物和中药活性成分，能为中药联合化疗药物治疗肿瘤提供新的思路。
本研究以PCL-PEG-PCL为载体，通过薄膜-水化-超声法成功制备了CUR/DOX micelle，提高了CUR和DOX的有效利用度；
有文献报道，以PCL-PEG-PCL制备胶束时，PEG的分子量大小对纳米胶束的载药量、包封率和稳定性影响比较大，相较于其他分子量的PEG（如PEG4000、PEG2000和PEG1000），PEG6000可以提供更加适宜的亲水疏水比例，制备的胶束载药量、包封率较高且稳定性好[26-28]，故本研究选择PEG6000作为亲水端。在前期研究中，采用单因素实验对PCLPEG-PCL分子量、药物与PCL-PEG-PCL的比例、有机溶剂的比例、水化温度、超声功率、超声时间等因素进行考察。在对PCL-PEG-PCL分子量的单因素实验中分别考察了PCL4500-PEG6000-PCL4500、PCL10000-PEG6000-PCL10000和PCL8000-PEG6000-PCL8000，发现PCL8000-PEG6000-PCL8000制备的胶束最为合适；
在正交实验中，选择对胶束制备影响较大的因素：药物与PCL-PEG-PCL的比例、水化温度和超声时间作为考察因素进行优化，得到粒径合适，分布均匀，载药量和包封率均较为理想的胶束；
本文采用最优制备工艺制得的CUR/DOX micelle的粒径为（150.0±0.6）nm，大小均一；
稳定性考察结果表明，72 h内胶束在去离子水和含10%胎牛血清的水溶液中稳定性良好；
体外释放考察表明CUR/DOX micelle具有缓释作用；
细胞摄取结果表明，在相同浓度下相较于游离DOX，CUR/DOX micelle的入胞能力更强，这有利于更好地发挥抗肿瘤作用；
体外实验结果显示，对于人乳腺癌MCF-7细胞，载体PCL-PEG-PCL无明显的生长抑制作用，CUR/DOX micelle组的抑制作用强于游离CUR组、游离DOX组、单载CUR组和单载DOX组，这可能是CUR和DOX联用共同发挥了抗肿瘤作用，并且制成胶束后有效地提高了药物的入胞能力。采用CompuSyn 软件分析联合药物指数，当CUR质量浓度大于5.2 μg·mL-1，DOX质量浓度大于1 μg·mL-1时，CUR和DOX联用具有协同作用。在后续的工作中，将进一步研究CUR/DOX micelle的活性及抗肿瘤作用机制，为后续研究奠定基础。