郭冰峰，韩斌，郝一楠，王魁，殷吉祥，李岩，李楠，凌相平，潘若文
华兰生物疫苗股份有限公司，河南 新乡 453003
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）的发现最早追溯到2019年3月，西班牙巴塞罗那大学在采集的废水样本中检测出SARS-CoV-2，2020年3月11日，WHO将新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）作为全球性大流行病［1-6］。
SARS-CoV-2属冠状病毒科冠状病毒属，为包膜病毒，基因组长29 800～29 900 bp，具有冠状病毒的典型形态和基因组特征；
SARS-CoV-2普遍呈球形，具有多形性，直径60～140 nm［7-8］。人群普遍易感，特别是中老龄人及婴幼儿，经呼吸道飞沫和密切接触传播，以发热、干咳、乏力为主要表现；
部分患者以嗅觉、味觉减退或丧失等为首发症状，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、结膜炎、肌痛和腹泻等症状［9-10］。
目前尚无有效治疗COVID-19的特效药，接种疫苗可使人体获得一定的免疫力［11-14］。国内接种量最大的疫苗类型为灭活疫苗，灭活疫苗的生产步骤通常为以Vero细胞为宿主，通过细胞工厂或生物反应器进行病毒的增殖培养［15-16］，病毒收获液经β-丙内酯灭活后进行灭活验证，完全灭活的收获液经过滤、纯化等工艺，最终制得成品疫苗［17-18］。为保证生产过程中质量的稳定性，本研究采用Karber法对病毒收获液以及灭活样本进行滴度检测［19］，在保证收获液质量的基础上，进一步确保灭活工艺能够完全灭活病毒，为新冠疫苗的安全研发奠定基础。
1.1 病毒、病毒收获液及细胞株SARS-CoV-2毒株（工作代次为V8代）由广东省疾病预防控制中心提供；
病毒收获液为华兰生物BSL-3实验室5 L生物反应器培养产物，批号分别为202111001、202111002和202111003；
非洲绿猴肾细胞（Vero）购自美国标准生物品收藏中心（ATCC CCL-81）。
1.2 主要试剂DEME培养基（货号：10564011）、0.25%胰酶（货号：25200072）和胎牛血清（货号：10099141）购自美国Gibco公司。
1.3 Vero细胞培养板的制备 取长至致密单层的Vero细胞培养瓶，吸弃生长液，加入胰酶消化5～10 min，吸弃胰酶，加入生长液制备细胞悬液，通过细胞计数，将细胞悬液稀释至2×105个／mL，接种至96孔细胞培养板，100 μL／孔，第10列补加100 μL维持液作为阴性对照，置37℃，5% CO2培养箱中培养细胞至单层，转入生物安全三级实验室备用。
1.4 病毒滴度稳定性检测 采用Karber法。取2021-11001、202111002和202111003批病毒收获液，于2～8℃放置12 d，每隔3 d（0、3、6、9、12 d）取样100 μL，测定病毒滴度：加至900 μL维持液中进行10倍系列稀释（10-1～10-9），取不同稀释倍数的病毒液100 μL，接种至96孔细胞板，每个稀释度接种8孔，置37℃，5%CO2培养箱中培养5～7 d，以病变孔数不再增加、阴性对照细胞未老化之前进行滴度终点判定。
1.5 灭活动力学检测 取202111001、202111002和202111003批病毒收获液，于2～8℃冰箱过夜平衡温度，按1∶4 000的体积分数加入β-丙内酯，混匀后立即使用离心管进行样品分装，分装的样品继续放至2～8℃冰箱进行灭活，并在不同的试验条件下进行滴度检测和灭活验证，检测时间点为0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、8.0、16、24 h，前7个时间点（0～4.0 h）检测病毒滴度，后3个时间点（8.0、16、24 h）检测病毒滴度并进行灭活验证。
1.6 灭活验证
1.6.1 盲传3代 取长至单层Vero细胞的T75细胞瓶，吸弃上清，补加8 mL维持液；
吸取25 mL灭活液加至T75细胞瓶内，每个样本设3个重复，阳性对照为吸取25 mL病毒收获液（病毒含量10 CCID50）加至T75细胞瓶内，阴性对照为吸取25 mL维持液加至T75细胞瓶内，于37℃，5%CO2条件下进行盲传1代培养；
培养5 d后吸取盲传1代上清液25 mL，加至T75细胞瓶内（含8 mL维持液），于37℃，5% CO2条件下进行盲传2代培养；
培养5 d后吸取盲传2代上清液25 mL，加至T75细胞瓶内（含8 mL维持液），于37℃，5%CO2条件下进行盲传3代培养。5 d后判定终点，观察每次传代培养是否病变，3代3个重复均无病变则证明灭活完全。
1.6.2 滴度检测 采用Karber法对传代样本进行滴度检测，具体操作步骤同1.4项。
1.7 病毒灭活液电镜观察 取灭活24 h的病毒灭活液，加入戊二醛固定，使其终浓度为2.5%，置2～8℃冰箱过夜保存。吸取固定样品20 μL，滴加至有喷碳支持膜的铜网上，使之形成小液滴，放置1 min后用滤纸吸弃多余液体，纯化水洗涤1次后，滴加1%醋酸双氧铀染液，染色1 min；
吸弃多余染液，自然干燥后进行透射电镜观察。
2.1 病毒滴度稳定性202111001、202111002和2021-11003批病毒收获液于2～8℃环境下放置12 d，滴度呈下降趋势，第3天滴度下降幅度不明显，病毒滴度降幅分别为1.6%、2.1%和5%；
第12天病毒滴度降幅分别为25.8%、22.9%和16.7%。见表1。
表1 3批SARS-CoV-2收获液放置不同时间的滴度变化（lgCCID50／mL）Tab.1 Changes of titers of three batches of SARS-CoV-2 harvest solution stored for different time durations（lgCCID50／mL）
2.2 灭活动力学检测202111001和202111002批病毒收获液均灭活2 h检测不出病毒滴度，202111003批病毒收获液灭活3 h检测不出病毒滴度，因此，病毒收获液经3 h灭活处理均可将病毒完全灭活，见表2。
表2 3批SARS-CoV-2收获液灭活动力学滴度检测结果（lgCCID50／mL）Tab.2 Inactivation kinetic titers of three batches of SARS-CoV-2 harvest solution（lgCCID50／mL）
2.3 病毒灭活验证 灭活8、16、24 h的病毒收获液盲传3代样品均无细胞病变，每次传代样品均未检出病毒滴度；
阳性对照细胞发生完全病变，阴性对照细胞未发生病变。见图1。表明1∶4 000体积分数的β-丙内酯处理8 h以上能够完全灭活SARS-CoV-2。
图1 灭活验证样品的显微镜观察（×40）Fig.1 Microscopy of inactivation verification of samples（×40）
2.4 病毒灭活液电镜观察 透射电镜观察可见，灭活的病毒呈圆球状，直径约100 nm，包膜周围有明显的刺突蛋白且分布均匀，见图2。表明该灭活工艺对病毒颗粒完整性影响不大。
图2 灭活的SARS-CoV-2的透射电镜观察Fig.2 Transmission electron microscope observation of inactivated SARS-CoV-2
目前国内已上市的新冠疫苗种类有灭活疫苗、腺病毒疫苗以及重组亚单位疫苗，其中灭活疫苗是国内接种量最多的疫苗类型［20-22］；
对于灭活疫苗的研发及生产，其滴度稳定性影响成品的质量，病毒灭活工艺参数决定产品的安全，因此，对于SARSCoV-2滴度稳定性以及灭活动力学研究显得至关重要［23-25］。
本研究采用Karber法对置于2～8℃的SARSCoV-2收获液进行滴度检测，病毒滴度随着放置时间的延长不断降低；
放置3 d后，3批样本的滴度降幅为1.6%、2.1%和5%，放置12 d后，滴度降幅达25.8%、22.9%和16.7%，表明2～8℃环境下SARS-CoV-2滴度稳定性较差；
为保证后续纯化工艺顺利进行，建议病毒收获液于3 d内进行灭活处理。
灭活动力学研究中，按1∶4 000的体积比加入β-丙内酯处理3 h以上，病毒滴度降至0，表明β-丙内酯能够有效灭活SARS-CoV-2；
无论是7.875 lgCCID50／mL的高滴度病毒，还是5.75 lgCCID50／mL的低滴度病毒，β-丙内酯均能在3 h内灭活完全，表明在此滴度范围之内，灭活剂的加入量是足量且冗余的。WANG等［18］的研究表明，β-丙内酯在4 h内将病毒灭活完全，与本研究结果差异不大。本研究对灭活8、16、24 h的样本进行灭活验证，表明病毒完全灭活；
对SARSCoV-2进行电镜观察，发现灭活24 h的样本病毒颗粒完整，刺突蛋白分布均匀，与GAO等［17］和WANG等［18］的研究一致。表明该灭活工艺对SARS-CoV-2颗粒完整性影响较小，为后续生产工艺以及灭活时间的确定提供了理论依据。
综上所述，本研究对SARS-CoV-2在2～8℃环境下的滴度稳定性以及灭活动力学进行了探讨，在保证病毒收获液质量的基础上，进一步确保了灭活工艺能够完全灭活病毒，为新冠灭活疫苗的安全研发奠定了基础。
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