廖小妹，陈美丽，王玺舜，唐博翔，何文智*
1.湖南中医药大学口腔医学院，湖南 长沙 410208；
2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；
3.湖南中医药大学附属长沙市中医医院，湖南 长沙 410002
非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是以肝细胞脂肪变性、蓄积，炎症性坏死为病理特征，以炎症反应、胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）为病理机制，无过量饮酒史的临床综合征。NAFLD 作为一种潜在的进行性肝病，有25%左右的脂肪变性发展为肝脏炎症并进展为非酒精性脂肪性肝炎[1]，持续的肝损伤和细胞死亡将导致纤维化，最终导致肝硬化和肝癌[2-3]，并且在早期一般不具有临床治疗指征。
目前，疾病发展过程中得到普遍肯定的NAFLD 发病机制是“多次打击”学说，它阐述其基本表现为由肝细胞内甘油三酯(triglyceride, TG)的蓄积，逐渐过渡成肝组织坏死性炎症和纤维化，进行性发展为肝硬化和肝癌，成为NAFLD患者致死的主要因素[4]。
减少炎症反应、降低肝细胞损害程度、促进患者肝功能恢复、提高生活质量是临床研究NAFLD 的目标[5]。目前，治疗该疾病主要包括生活方式干预、手术、辅助药物等[6-8]，虽有一定的治疗效果[9]，但长期服用效果不佳、肝毒性较大，停药后的反弹现象使其临床依从性差[10]。
中医学认为NAFLD 是膏粱厚味诱发，导致湿、痰、瘀互结的病理因素[11]。
中医药治疗疑难杂症，数千年来积累了很多有效的治疗手段。
临床中医运用辨证治疗NAFLD[12]，针灸[13]、推拿[14]、穴位埋线[15]等治法，均获得较好疗效，中医药治疗作用温和、成本低、治疗依从性高等优势，尤其适用于需长期治疗的慢性代谢性疾病[16]。综上所述，临床更期待从传统中药组方中寻找新的NAFLD 治疗方法。
加味消脂利肝方是临床医家在丹栀逍遥散及保和丸基础上加减化裁而组成，具有疏肝解郁、消脂利肝的功效。
前期临床研究中，明确了丹栀逍遥散降脂的有效性，疗效显著，安全性高[17]。
加味消脂利肝方疏肝软坚，健脾消积，解毒散瘀；
方中黄连抗炎、降血脂、解热，并通过抑制神经氨酸苷酶进而影响脂肪变性[18]，属于NAFLD 临床辨证用方君药之一。
但该药方的药效作用机制尚不明确，活性成分及靶点关联性未知。
基于此，本研究拟采用网络药理学探索加味消脂利肝方干预NAFLD 的机制，为加味消脂利肝方的临床应用提供科学依据，同时实验验证加味消脂利肝方治疗NAFLD 的疗效。
1.1 加味消脂利肝方药物靶点筛选
借助TCMSP收集加味消脂利肝方各中药的化学成分[19]。设定口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18[20]为TCMSP 数据库的筛选条件，获得活性成分及作用靶点后，将化合物作用的靶点转化为UniProt 蛋白质数据库标准化的靶点，限定物种为“Homo sapiens”。
1.2 非酒精性脂肪肝疾病靶点库建立
用“Non alcoholic fatty liver disease”“Non-alcoholic fatty liver disease”“NAFLD”为疾病关键词，通过GeneCards、OMIM 数据库筛选NAFLD 的潜在靶点。
在GeneCards 数据库中，Score 值和该靶点与疾病联系成正相关， 选取相关性分数＞5 的靶点，取两个数据库信息的并集，建立疾病靶点库。
1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络构建
疾病与药方靶点取交集并绘制韦恩图，并提交至STRING 数据库构建PPI 网络模型[21]，生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”（＞0.9），获得PPI 网络，并通过Cytoscape 3.9.0 中的MCODE 插件对PPI 网络进一步分析获取关键靶点。
1.4 基因本体（gene ontology, GO）分析与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析
应用MetaScape 数据平台对加味消脂利肝方与NAFLD 交集靶点进行GO、KEGG 通路富集分析。
2.1 材料
2.1.1 动物 SPF 级SD 大鼠，体质量(200±20) g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司出售，实验动物许可证SYXK(湘)2019-0009，湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准伦理编号：XMBH-202110290006。
2.1.2 仪器 Motic 显微镜（北京荣兴光恒科技有限公司，货号：BA210T）；
SQ2125 石蜡切片机（金华市益迪医疗设备有限公司，货号：YD-315）；
包埋机（常州市中威电子仪器有限公司，货号：BMJ-A）；
盖玻片（货号：DY89-1）、载玻片（货号：AY89-2）均购自海门市远泰实验器材厂；
全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司，货号：JXFSTPRP-48）；
PVDF膜（上海玉博生物科技有限公司，货号：IPVH00010）。
2.1.3 药物 加味消脂利肝方组成：黄连6 g，柴胡30 g，生白芍10 g，广郁金15 g，莪术10 g，山楂10 g，丹参10 g，大黄15 g，炒枳壳10 g，泽泻10 g，炒白术15 g，茯苓15 g（湖南中医药大学第一附属医院中药房购买，批号：2110001S、2105004S、2108003S、2104001S、2108005W、2109003S、2109004S、2108017W、2108007C、2109008S、2106028C、2110011C)。
辛伐他汀（成都恒瑞制药有限公司，批号：211005）。
2.1.4 试剂 血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C采用ELISA 试剂盒检测（厂家：南京建成生物工程研究所有限公司，批号：20220512、20220511、20220513、20220512、20211225、20211225）；
中性树脂（长沙艾碧维生物科技有限公司，批号：20220206）；
苏木素伊红染色液（长沙艾碧维生物科技有限公司，批号：01A20211223）；
PBS（长沙艾碧维生物科技有限公司，批号：20220111）。
2.2 方法
2.2.1 造模及药物制备 NAFLD 模型：利用HFD诱导法造模[22]：持续高脂饲料（高脂饲料配方：普通饲料70%，1%胆固醇，10%猪油，10%蔗糖）喂养6周后，随机选取4 只解剖，观察大鼠肝脏脂肪变，判断模型建立是否成功。
将中药饮片按剂量比例称取156 g，水煎煮3 次，每次1 h，合并3 次煎煮滤液，浓缩至200 mL，即加味消脂利肝方生药浓度0.78 g·mL-1。
2.2.2 分组及给药 采用SPSS 25.0 以简单随机抽样法将大鼠分为空白组（n=5），模型组（n=5），加味消脂利肝方低、中、高剂量组（n=5），阳性药组（辛伐他汀组，n=5）。按大鼠体质量每100 g 灌胃1 mL 计算，每天上午加味消脂利肝方低、中、高剂量组分别给予3.9、7.8、15.6 g·kg-1加味消脂利肝方灌胃，阳性药组给予0.15 mg·kg-1辛伐他汀（按体质量70 kg成人每天10 mg 计算）。
空白组、模型组给予同体积生理盐水灌胃。
各组均灌胃2 周。
2.2.3 血清脂质指标及肝功能指标检测 于8 周末实验结束后腹主动脉取血，常温下静置血液1 h，后离心取上清液，用于测定各组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST 水平。
2.2.4 HE 染色 实验结束后取材，心脏灌注，取肝脏以多聚甲醛固定用于病理染色，将固定的肝组织脱水，石蜡包埋。60 ℃烤片12 h。切片脱蜡至水：先将切片3 次置于二甲苯中，每次20 min，然后依次置于100%、95%、85%、75%乙醇中5 min。
再用蒸馏水浸洗5 min，苏木素染5 min，蒸馏水冲洗，PBS 返蓝，伊红染5 min，蒸馏水冲洗，梯度乙醇（95%～100%）脱水，每级5 min（或者直接把切片烤干）。取出后置于二甲苯10 min，2 次，中性树胶封片，显微镜观察和记录细胞形态的变化。
2.2.5 统计学分析 使用SPSS 25.0 统计软件进行分析，两组或多组数据比较用单因素方差分析或秩和检验。
P＜0.05 代表差异有统计学意义。
3.1 网络药理学预测结果
3.1.1 加味消脂利肝方的潜在活性成分及靶点 通过TCMSP 数据库检索到加味消脂利肝方的化学成分1263 个。
通过筛选条件，最终得到加味消脂利肝方的潜在活性成分168 个。
经TCMSP 数据库检索，得到作用靶点996 个，合并后删除重复值，得到靶点258 个。将加味消脂利肝方所含的12 味中药及预测的258 个相关靶点蛋白，利用Cytoscape 3.9.0 软件中的功能对其进行分析，构建“中药-活性成分-作用靶点”网络及可视化。
详见图1。
图1 加味消脂利肝方“中药-活性成分-作用靶点”网络图
3.1.2 NAFLD 疾病靶点的获取 从GeneCards、OMIM 数据库搜索，得NAFLD 靶点2652 个，合并去重后共得到2552 个NAFLD 疾病靶点。
运用Venny平台将潜在活性成分的作用靶点与NAFLD 疾病靶点合并后取交集，最终获得148 个加味消脂利肝方治疗NAFLD 的潜在靶点。
详见图2。
图2 加味消脂利肝方靶点-NAFLD 靶点韦恩图
根据以上信息筛选得到33 个加味消脂利肝方治疗NAFLD 的活性成分（表1）。其中君药预测得到22 个活性成分，包括黄连3 个、柴胡5 个、丹参8个、大黄6 个；
臣药筛选得到活性成分11 个，包括白芍4 个、郁金2 个、莪术1 个、山楂叶4 个；
佐使药预测得到12 个活性成分，包括枳壳5 个、泽泻3 个、白术3 个、茯苓1 个。
表1 加味消脂利肝方治疗NAFLD 的活性成分
3.1.3 PPI 网络构建结果 将148 个潜在靶点信息录入STRING 平台构建PPI 网络。
设最低要求交互分数：最高置信度为0.900，结果显示，该网络一共含有靶蛋白节点数132 个。详见图3。将上述结果导入Cytoscape 3.9.0 中进行关键靶点分析，根据MCC 方法选取的加味消脂利肝方治疗NAFLD 的关键靶点，预测关联系数前10 的靶点为核心靶点。
详见图4。
图3 靶点PPI 网络图
图4 靶点PPI 关键靶点预测
3.1.4 GO 分析与KEGG 通路富集分析结果 对筛选得到的148 个NAFLD 靶点进行GO、KEGG 通路分析。
根据P＜0.01 筛选出2105 条GO 分析结果，包括生物过程（biological process, BP）1846 个、细胞组分（cellular component, CC）97 个、分子功能（molecular function, MF）162 个。
根据靶点富集数目进行筛选，运用在线生物网站绘制排名前10 的结果。
详见图5。
同时，以P＜0.01 作为条件进行筛选，共富集得到198 条通路，并筛选出靶点富集数目排名前20 的结果[23]。
详见图6。
分析结果表明，加味消脂利肝方治疗NAFLD 的作用靶点涉及的通路有PI3KAkt 信号通路、MAPK 信号通路、TNF 信号通路、NFκB 通路等。
图5 GO 分析图
图6 KEGG 通路分析富集气泡图
3.2 加味消脂利肝方对NAFLD 大鼠模型的作用
3.2.1 模型判定 空白组大鼠肝脏颜色呈均匀红褐色，边缘锐利，质软。模型组肝脏体积增大，颜色呈暗土黄色，边缘圆钝，包膜紧张，质地变脆。
详见图7。3.2.2 血清指标检测结果 模型组血清TG、TC、LDL-C、ATL、AST 水平明显高于空白组（P＜0.05 或P＜0.01）、HDL-C 水平低于空白组（P＜0.01）。
治疗2 周后，与模型组相比，加味消脂利肝方中剂量组血清TG、TC、LDL-C、ATL、AST 水平降低（P＜0.05）， 血清HDL-C 水平升高（P＜0.05）；
阳性药组血清TG、TC、LDL-C、ATL、AST 水平降低（P＜0.05），血清HDL-C水平升高（P＜0.05）。
详见图8。
图7 大鼠肝脏肉眼观察图
图8 各组大鼠血清指标
3.2.3 加味消脂利肝方对SD 大鼠肝组织病理学的影响 与空白组比较，模型组肝脏可见内脂滴性空泡及炎症性浸润。
与模型组相比，加味消脂利肝方低、中、高组肝脏内脂滴性空泡显著减少，阳性药组的脂肪变性及炎症坏死明显改善。
详见图9。
图9 SD 大鼠肝组织HE 染色结果（×400）
随着生活饮食习惯的改变，我国慢性代谢性肝脏疾病发病率不断上升，因肝脏炎症性坏死，脂肪变性造成肝功能损伤最终导致的肝纤维化、肝硬化逐年增加，尤其是中老年更为严重，长期治疗使患者承受了极大的心理和经济压力[24]。
NAFLD 的全球患病率为25%，据报道，南美洲为30.45%、亚洲为27.37%、北美洲为24.13%、欧洲为23.71%、非洲为13.48%，其中，中东地区的患病率最高，为31.79%[25-26]，患病率在全球范围内呈上升趋势。
研究证明肝脂肪沉积是NAFLD 的重要病理改变，其病理改变具有可逆性，常可通过改变生活方式缓解，然而早期NAFLD无特异性诊治手段，改变生活方式对患者挑战性大，因此临床重点探索潜在的治疗药物[26]。
中医学将脂肪肝归属于“胁痛”“积聚”“湿浊”等病的范畴，其发病可由饮食失调、过食肥甘厚味、缺少运动以及情志所伤引起，本虚标实，肝郁为发病关键环节，脾虚为病机，痰瘀互阻为主要病理因素贯穿疾病始终[27]，临床中医治疗以张仲景“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”的理论为基础[28]，中药方以调肝兼理脾药为主。
近年来，随着饮食结构和生活方式的改变，不同患者表现出的疾病征象不尽相同[29]，因此，NAFLD 的早期筛查有利于及时发现疾病并延缓疾病的进展，符合中医学“治未病”理论[30]。
本实验分析发现，与模型组比较，加味消脂利肝方中剂量组TG、TC、LDL-C 水平降低（P＜0.05），HDLC 水平升高（P＜0.05），肝功能ALT、AST 水平改善（P＜0.05），加味消脂利肝方能明显改善大鼠血清血脂及肝功能，肝脏组织病理得到明显改善，为后续进一步实验验证提供了部分基础，而改善脂质指标及肝功能指标未成剂量依赖性，可能与肝脏代谢功能受损，无法代谢高浓度药量有关，但其肝组织病理学改变有一定剂量变化趋势，其结果具有临床意义。
对于中药治疗NAFLD 作用机制，网络药理学可以较好的预测[31]。
有研究表明，TCMSP 筛选结果中活性成分小檗碱已被用于治疗代谢综合征，尤其是通过调节肠道菌群治疗NAFLD[32]。
小檗碱增加了SCFA 诱导的细菌增殖，并降低了肥胖和瘦素水平，增加了胰岛素敏感性和脂联素水平，增加益生菌双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。同时小檗碱[33]降低NAFLD肝细胞活性、IL-6 和TNF 水平[34]，下调NF-κB活 性，抑制肝脏炎症反应的产生[35]。
柚皮素可通过EGFRPI3K-Akt/ERK-MAPKinase 通 路，降低NF-κB 活性、抑制肝脏炎症反应[36]，同时，山柰酚可通过抑制Tyk-STAT 信号通路，改善炎症反应导致的代谢性疾病[37]。
IL-6、TNF、IL-4、IL-10 等炎症因子诱导的炎症反应[38]是NAFLD 发生发展中导致肝细胞脂肪变性、脂肪蓄积后肝组织坏死性炎症和纤维化不可逆转的损伤，引起肝功能受损的物质基础[39]，尤其IL-6 作为一种重要的炎症因子和脂肪因子，可以诱导机体产生IR[40]。
IL-6、TNF-α 的水平增高是导致疾病发生的一个重要因素，槲皮素浓度与巨噬细胞中胆固醇外流和ABCA1 mRNA 及其蛋白质的表达呈正相关[41]，槲皮素能减轻肠道损伤、改善肠屏障完整性、调控肠道菌群[32]，进而改善脂质代谢[42]。
木犀草素能降低巨噬细胞中总胆固醇水平，并改善脂质代谢和抑制炎症反应[43]，这些活性物质是中药方中的常见成分，预期对疾病治疗效果与实验结果相互印证。
综上所述，基于网络药理学结合实验研究，对加味消脂利肝方治疗NAFLD 的作用机制进行预测，证实了加味消脂利肝方发挥了治疗NAFLD 的作用，且具有多成分、多靶点、多途径的作用机制特征。目前实验研究进一步论证其分子机制，加味消脂利肝方中君药黄连含有活性成分小檗碱，小檗碱作为影响肠道菌群治疗代谢性疾病的主要活性成分，抑制炎症因子改变肠道菌群进而治疗NAFLD，为后续实验验证加味消脂利肝方治疗NAFLD 的药效物质基础提供一定的思路，其中肠道菌群在加味消脂利肝方治疗NAFLD 中发挥的作用，期待试验的进一步验证。
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