张 剑 杨荟玉 张自森 王利娟 张红巧 郭彦伟
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤和第3位的肿瘤致死病因，严重地威胁我国人民的生命健康[1-2]。AHCS治疗经皮穿刺肝癌，通过高压氩气的超低温以及高压氦气产生的热效应最大限度的杀伤肿瘤组织[3]。大量的研究指出， AHCS-TACE联合治疗在中晚期肝癌患者中疗效更佳[4]，并且安全性较佳。但有研究指出，AHCS-TACE治疗可能只在部分患者中提供明显的生存益处。目前，在临床实践中尚缺乏识别AHCS-TACE联合疗法最佳响应者的生物标志物[5-6]。探索一种高特异性的生物标志物以区分AHCS-TACE联合治疗响应良好的患者，能够显著的改善中晚期肝癌的治疗效果，并降低患者的医疗成本，具有重要的临床意义。Tim-3表达于肿瘤浸润免疫细胞中，参与调节免疫细胞对肿瘤的免疫杀伤效应[7]。有研究指出免疫杀伤效应在AHCS-TACE联合疗法的抗肿瘤效应中扮演关键角色[8]。此外，临床研究指出Tim-3的表达含量上升与患者的疾病进展以及不良预后显著相关[9]。在本次研究中，我们探索了免疫细胞表面Tim-3表达含量与AHCS-TACE联合治疗响应的相关性，以期为TACE+AHCS联合治疗的患者提供一种高特异性的生物标志物，从而实现疗效不佳的患者进行提早区分以及个体化治疗从而改善患者的预后。
1.1 一般资料
选择2016年11月至2020年11在我院接受TACE-AHCS联合治疗的肝细胞癌患者共102例。本研究的纳入标准为：①患者年龄在18～75岁之间；
②根据EASL或AASLD指南确诊为诊断为肝细胞癌；
③BCLCB或C期，不具备手术切除或移植的候选资格；
④Child-Pugh A或B级；
⑤肾功能正常(血清肌酐浓度1.5倍或低于正常范围的上限)；
⑥ECOG评分为0～2分。排除标准：①门静脉主干完全被癌栓栓塞；
②有肝脏切除或肝脏移植史；
③接受过靶向治疗或全身性的化疗。在接受治疗前，进行肿瘤活检，对肿瘤样本进行免疫组化检测肿瘤浸润淋巴细胞中Tim-3蛋白表达水平。肿瘤浸润淋巴细胞上Tim-3蛋白阳性率>5%，被定义为Tim-3高表达。102例患者，根据Tim-3蛋白阳性率是否>5%，分为Tim-3高表达组以及Tim-3低表达组。本研究已被我院伦理道德委员会批准，所有患者均签署知情同意书。
1.2 治疗方法
TACE的治疗方法如文献所示[10]，这里简述如下：由三位介入科医生进行介入治疗。置入5-Fr YASHIRO或RH导管，并进行内脏血管造影以评估肝动脉供应。将2.7-F微导管置入合适位置，并缓慢注射5～20 ml脂碘醇与20～40 mg表柔比星，直到血流减慢。最后，必要时注射350～560 μm的聚乙烯醇颗粒，以减少肿瘤血流。动脉化疗栓塞术后14天，复查血常规、凝血常规及肝肾功，复查CT观察碘油沉积情况，排除禁忌证后，签署知情同意书后行超声联合CT引导下氩氦刀冷冻消融治疗。手术由CT扫描引导。应用氩气低温消融系统和17号冷冻消融针进行。使用1至5个冷冻消融针，以实现冰球完全覆盖肿瘤，随后重复CT扫描观察消融范围，确保冰球边界超过靶区边缘5 mm以上，关闭氩气并切换氦气复温至20 ℃以上，再次重复以上氩气冷冻-氦气复温循环；
5 min后复查胸腹部CT，观察有无胸腔及腹腔出血。术后给予生命体征监测、保肝、补液及对症支持治疗5～7天。视复查情况间隔4～6周重复以上治疗过程。
1.3 观察指标
所有患者均通过门诊复查或电话随访至2021年11月，随访时间为12～60个月，平均(34±11)个月，记录患者疾病复发及生存情况。本次研究的主要终点包括：总生存期(OS)，定义为从第一次TACE治疗开始到死亡或最后一次随访的时间。次要终点包括肿瘤反应和肿瘤进展时间(TTP)，肿瘤进展时间是指从第一次TACE治疗开始到放射性肿瘤进展、死亡或最后一次随访的时间。肿瘤评价指标包括客观反应率(ORR)，包括完全反应(CR)和部分反应(PR)病例。入院时对并发症进行临床观察，出院后通过电话访谈进行评估。
1.4 T淋巴细胞亚群水平检测
在治疗后应用ELISA实验方法检测所有患者T淋巴细胞亚群水平，包括CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平，T淋巴细胞亚群检测试剂盒购自美国abcam公司，严格按照试剂盒说明书操作。
1.5 统计学分析
所有统计分析均使用SPSS 23.0版软件进行。2组之间的连续变量用mean±SD表示，组间比较采用t检验。分类变量用百分比和频率表示，并使用χ2检验进行比较。生存曲线用Kaplan-Meier方法构建，组间生存差异分析采用Log-rank检验用对数秩检验进行比较。使用Cox"s回归模型进行各种参数的单变量和多变量分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 2组患者一般资料比较
本次研究Tim-3低表达患者54例，Tim-3高表达患者48例。2组患者在性别、ECOG评分、Child-Pugh分级、肿瘤大小、AFP水平、有无门静脉侵犯相关指标均无统计学差异。见表1。
表1 2组患者一般资料(例，%)
2.2 2组患者客观缓解率对比
治疗3月之后，Tim-3低表达组患者的ORR为74.1%，Tim-3高表达组患者的ORR为39.6%，Tim-3低表达组患者对TACE-AHCS联合治疗的响应优于Tim-3高表达组患者，数据比较差异具有统计学意义(χ2=4.177,P<0.05)，如表2所示。
表2 2组患者ORR比较(例，%)
2.3 2组患者中远期疗效对比
2组患者均进行了为期3年的随访，在最后一次随访中，Tim-3低表达组患者和Tim-3高表达组分别有14例以及5例患者存活。Tim-3低表达组的中位OS为27.07月，Tim-3高表达组为19.79个月，2组差异具有统计学意义(χ2=21.714，P<0.05)。Tim-3低表达组的中位TTP为16.41个月，而Tim-3高表达组为11.49个月，数据比较差异具有统计学意义(χ2=22.886，P<0.05)。见图1。
图1 2组患者中远期疗效比较
2.4 2组患者治疗后T淋巴细胞亚群水平比较分析
TACE-AHCS联合治疗3月后，Tim-3低表达组患者的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T细胞水平均显著高于Tim-3高表达组患者，数据比较差异具有统计学意义(P<0.05)，如表3所示。
表3 2组患者治疗3月后T淋巴细胞亚群水平
2.5 2组患者中远期疗效的预后因子分析
单因素分析显示，有无腹水、有无门静脉瘤栓、肝内肿瘤最大直径、肿瘤生长方式以及Tim-3表达含量与OS和TTP显著相关(P<0.05)，此外，多因素分析显示，有无门静脉瘤栓和肝内肿瘤的最大直径以及Tim-3表达含量是OS和TTP的统计学意义上的预后因素(P<0.05) ，如表4、5所示。
表4 影响患者TTP的预后因子分析
表5 影响患者OS的预后因子分析
原发性肝癌是第4位的常见恶性肿瘤和第3位的肿瘤致死病因。尽管在过去的几十年里已经开发了各种治疗方法，但晚期肝癌的预后仍然很差[11]。目前的研究评估了TACE联合冷冻消融，研究指出联合组的完全缓解率和总有效率明显高于TACE组[4]。TACE联合AHCS可以为不可切除的HCC患者带来更多益处。联合治疗的效果明显优于单独的TACE或AHCS，且无重大并发症发生。然而，TACE联合AHCS治疗可能只有部分患者受益，但目前尚缺乏识别良好响应患者的生物标志物。
本研究评估了Tim-3低表达组以及Tim-3高表达组患者对TACE联合AHCS治疗的响应程度，及其对患者预后的意义。Tim-3低表达组以及Tim-3高表达组的中位OS(27.07月VS.19.79月，P=0.0001)和中位TTP(16.41月VS.11.49月，P=0.001)具有统计学差异。此外，多因素分析显示，有无门静脉瘤栓的存在和肝内肿瘤的最大直径以及Tim-3表达含量是OS和TTP的统计学意义上的预后因素。此项研究的研究结果表明，Tim-3表达含量可以作为肝癌患者对TACE联合AHCS治疗的预测因子。
Tim-3是一个较少被研究的免疫检查点分子，在调节免疫反应和诱导免疫耐受方面发挥着重要而复杂的作用。在部分肝癌患者肝癌组织的肿瘤细胞、肿瘤浸润T细胞、Tregs和TAMs中已经发现Tim-3的异常表达[12-13]。有研究指出，Tim-3的高表达与肝癌患者的预后显著相关。例如，Hastings等[14]研究发现，HCC组织中Tim-3+肿瘤浸润性T细胞的数量越多，患者的生存期越短。此外，Tim-3在外周血单核细胞中的表达可用于预测治疗性肝切除的HCC患者的复发[15]。复发性HCC患者在肝脏切除前后，外周血单核细胞中Tim-3+ CD4+T细胞和Tim-3+ CD8+T细胞的比例明显高于非复发性HCC患者。然而，目前探讨肝癌中Tim-3表达含量对患者治疗响应的研究较少。
在本次研究中，我们的研究结果指出，在治疗后与Tim-3低表达组相比，Tim-3高表达组患者CD8+T细胞水平显著降低。CD8+T细胞是发挥抗肿瘤功能的TILs的最重要组成部分。HCC中大量的CD8+TILs与合理的预后相关，包括改善OS、延长无复发生存期和延缓疾病进展[16]。CD8+细胞毒性T淋巴细胞可以直接接触并通过穿孔蛋白和颗粒酶裂解靶细胞，或通过Fas/FasL信号传导和分泌IFN-γ和TNF诱导靶细胞凋亡。Zhou G等[17]证明，Tim-3+的CD8+T细胞显示出最低水平的颗粒酶B、IFN-γ和TNF-α，此外机制研究指出，Tim-3与其配体Gal-9接触能够促CD8+T细胞耗竭。
此外，本研究结果表明，在治疗后与Tim-3低表达组相比，Tim-3高表达组患者CD4+T细胞水平显著降低。CD4+T细胞在HCC中发挥着从效应细胞功能到调节细胞功能的截然不同的作用[18]。CD4+Th1细胞在抗原刺激下产生高水平的IFN-γ和TNF-α，负责细胞介导的对细胞内病原体和肿瘤细胞的免疫[19]。有研究指出，Tim-3能够介导Th1细胞凋亡，Th1细胞的丧失能够促进肝癌的疾病进程生长[20]。这些研究均揭示了Tim-3高表达组患者预后较差的可能机制。
综上所述，Tim-3低表达组患者可能对TACE+AHCS联合治疗响应更好，治疗前，肿瘤浸润免疫细胞中Tim-3含量对TACE+AHCS联合治疗患者预后具有预测价值。基于Tim-3的高表达模式，应用Tim-3的免疫检查点抑制剂进行维持治疗，可能会改善接受TACE+AHCS联合治疗的患者的预后和完全反应率。
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