张嘉宾，徐 钊，周光余，张梦迪，符 杨，刘佳琪，周东海*
(1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；
2.塔里木大学动物科学学院，阿拉尔 843300)
目前，我国宠物行业发展迅速。急性肾损伤已成为危害宠物生命和健康的一种常见病，尤其在老年犬中发病率逐年上升。虽然肾损伤的治疗方法已十分成熟，不过对于急性肾损伤而言其治疗有一定难度。因此，找到更加快速、简便、经济且有效地治疗犬急性肾损伤的方法在当前宠物医疗行业迅速发展的阶段具有重要现实意义。袁玲等[1]研究发现采用主客配穴的方法对急性胰腺炎与急性肾损伤的大鼠进行治针灸治疗，减轻炎症作用，同时降低动物肾损伤程度。张俊川[2]报道，选取内关、足三里等穴位针灸局灶性大脑皮层梗死模型大鼠，发现电针能减轻炎性因子的表达，减轻肾的受损程度，保护肾功能。梁鑫[3]研究发现选择肾俞和足三里两个穴位针刺能够通过增强肾功能，减少有害物质在体内的蓄积，同时作用于细胞凋亡相关的信号通路，减轻肾横纹肌的溶解程度，降低肾的病理损伤程度。王冰舒[4]发现电针治疗急性肾衰竭后机体的抗氧化能力得到提高，其抗氧化相关蛋白的表达明显增强，同时肾的损伤程度明显减轻。这说明中医治疗对于肾的保护和肾功能的恢复具有很好的疗效，尤其是针灸治疗的方法，其可行性强，应用广泛。邹晓彪等[5]研究发现急性肾衰竭的发病过程中存在氧化应激反应，而氧化应激损伤也存在于急性肾衰竭的致病机制之中。郭艳辉[6]研究发现急性肾衰竭兔的氧化应激作用在电针治疗后得到明显改善，同时NRF2信号通路上的抗氧化蛋白HO-1的表达明显的增加。因此，对于急性肾衰竭过程中的氧化应激反应的研究十分有必要。目前，有关肾损伤的治疗方法不尽相同，然而运用中兽医的电针疗法治疗犬急性肾损伤的研究少有报道。以比格犬为对象，探讨电针疗法对急性肾损伤犬的肾功能、钙磷代谢、抗氧化能力以及NRF2信号通路的作用研究，为犬急性肾损伤的治疗提供理论依据和新方法。
1.1 试验设计
选取2～3岁健康、体重相近比格犬24只，采用单因子完全随机区组试验设计，将试验犬随机分为对照组、造模组、常规治疗组、电针干预组、电针治疗组和联合治疗组。第1～15天为造模期，第16～30天为治疗期。本研究选用腺嘌呤制造急性肾损伤模型。造模的方法参考聂静等[7]的造模方法，即当试验犬的血清肌酐浓度达到基线的1.5倍时即判定为造模成功。造模期，除对照组外其余各组每日上午基础日粮添加75 mg·(kg·d)-1腺嘌呤，电针干预组每日下午电针治疗。治疗期，除对照组、造模组和电针干预组外，其余各组每日下午治疗。常规治疗组通过补液(5%葡萄糖氯化钠溶液)、利尿(呋塞米2 mg·kg-1)等方法对试验犬进行对症治疗，电针治疗组每日下午电针治疗，联合治疗组在电针治疗的同时根据试验犬的症状辅以对症治疗。
1.2 饲养管理
试验期间自由采食和饮水，单独笼子饲养。每天清理、消毒犬舍，随时观察犬健康状况。
1.3 电针操作方法
选取犬双侧肾俞(第2腰椎横突末端相对的髂肋肌沟中)、脾俞(倒数第2肋间，背最长肌与髂肋肌之间的肌沟中)、足三里(小腿外侧上1/4处，胫腓骨间隙中)、三阴交(内踝上方，胫骨内隆起与内踝连线下1/5处)、太溪(跟骨内测凹陷中)以及命门(第2、3腰椎棘突之间)；
试验犬保定、剃毛、消毒，选用1寸(0.30 mm×25 mm)一次性无菌针，快速进针法针刺上述穴位，直刺进针，捻转后接电针。用华佗牌电子针疗仪(SDZ-Ⅱ型)，选择疏密波，频率1档，每次电针持续20 min。电针干预组、电针治疗组和联合治疗组均在造模成功后连续电针15 d直至试验结束。
1.4 试验测定与方法
1.4.1 尿比重和血液生化指标 试验结束后收集各组尿液进行尿常规检测；
同时分别从各组犬前肢背侧皮下头静脉采集血液5 mL，用EDTA抗凝管收集，37 ℃水浴30 min后3 000 r·min-1离心15 min，将上清液分装到1.5 mL离心管中，置于-20 ℃保存待测生化指标。BUN、CRE、Ca2+、P3+、UA、SOD和MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.4.2 X光 根据拍摄部位调节腹部X光拍摄条件，设置管电压为56.00 kV，毫安秒为8.00 mAs，曝光时间为40.00 ms。将试验犬保定在台子上，拍摄X光。
1.4.3 H.E.染色 试验结束后，试验犬麻醉，取出左侧肾，将肾表面的血渍用生理盐水洗净，放入4%多聚甲醛缓冲液固定12～24 h。将固定好的组织用常规方法脱水后进行石蜡包埋。包埋后的组织块修理、切片、脱蜡、水化、苏木素染色3～5 min、乙醇分色5 s后用伊红染色数秒，分别用浓度梯度乙醇和二甲苯对切片进行脱水、透明，中性树胶进行封片处理后，光学显微镜下观察。
1.4.4 免疫组织化学染色 组织石蜡切片常规脱水、透明后用柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)加热修复，然后放入3 %双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶。切片封闭后用一抗4 ℃孵育过夜。PBS洗涤切片后滴加与二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50 min，DAB显色和苏木素复染3 min后脱水封片于光学显微镜下观察。
1.4.5 qRT-PCR 检测相关基因 用Trizol法提取肾组织总RNA，测定RNA的浓度和纯度；
根据NCBI主页GenBank已公布的目的基因序列，应Primer Premier 5.0软件设计引物，同时参考文献中提及的引物序列，引物中G+C含量应在40%～60%。qRT-PCR标准程序：95 ℃预变性10 min；
95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，循环40次，然后绘制曲线，使用2-ΔΔCt的方法计算目的基因在不同cDNA 模板中的相对表达量。
表1 目的基因及内参基因引物设计
1.4.6 Western blot 用RIPA裂解肾组织并提取总蛋白，BCA法测定总蛋白的浓度；
加入Loading Buffer在95 ℃下蛋白变性；
取适量的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，电泳结束后进行转印至PVDF膜，封闭1.5 h；
4 ℃过夜孵育一抗(KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1稀释比例为 1∶800；
β-actin稀释比例为1∶1 000)、HRP标记山羊抗兔二抗室温孵育2 h(二抗稀释比例为 1∶5 000)，显影。使用Image J软件进行蛋白条带的灰度值分析；
应用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计分析，采用One-way ANOVA、t检验方法对数据进行显著性差异分析。KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1一抗购自于Wanleibio 试剂公司，β-actin一抗和HRP标记山羊抗兔二抗购自ABclonal试剂公司。
2.1 电针疗法对AKI犬尿比重和血液生化指标的影响
由表2可知，与对照组相比，造模组犬尿比重数值降低；
与造模组相比，常规治疗组、电针干预组、电针治疗组和联合治疗组的尿比重数值均有不同程度的升高，但均低于对照组。
表2 尿比重的变化
由图1可知，与对照组相比，造模组犬血清CREA、BUN、UA、MDA以及血磷含量显著提高(P<0.01)，而血钙、血清与肾SOD水平显著降低(P<0.01)；
与造模组相比，常规治疗组、电针干预组、电针治疗组和联合治疗组的血清CREA、BUN、UA、MDA以及血磷含量显著降低(P<0.01)，而血钙、血清与肾SOD水平显著升高(P<0.01)。
B. 空白组; M. 造模组; R. 常规治疗组; Ei. 电针干预组; Et. 电针治疗组; C. 联合治疗组。对比空白组，*.P<0.01；
对比造模组，#.P<0.01
2.2 犬肾组织影像学观察
由图2可知，X光检测造模前试验犬肾结构、大小正常，被膜完整。造模结束后与第2腰椎对比肾体积明显增大，联合治疗后肾有所变小，但仍大于造模前肾大小。
A. 造模前；
B.造模后；
C.联合治疗后
2.3 犬肾组织病理学观察
HE染色结果如图3，空白组肾组织结构完整，造模组肾组织中有大面积肾小管上皮细胞发生肿大、空泡化、坏死，管腔内细胞碎片和颗粒、且肾间质存在瘀血。常规治疗组与各电针处理组中肾出现的病变相较模型组均有减轻趋势。
A.空白组;B.造模组;C.常规治疗组;D.电针干预组;E.电针治疗组;F.联合治疗组。扫描文章首页OSID码可查看彩图
2.4 KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1蛋白免疫组织化学染色
试验用 KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1单克隆抗体孵育组织切片进行免疫组织化学检测(图4)。各组肾组织均有KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1 4种蛋白表达，其主要分布于肾小管上皮细胞胞质中，另有少量分布于肾小球基底膜细胞胞质及肾间质中。造模组肾小管上皮细胞KEAP1蛋白阳性染色深，呈深棕色，NRF2、HO-1、NQO1蛋白阳性染色浅，呈浅棕色；
对照组肾小管上皮细胞KEAP1蛋白阳性染色浅，NRF2、HO-1、NQO1蛋白阳性染色深，呈深棕色，呈浅棕色。其余各治疗的KEAP1蛋白阳性染色均浅于造模组，深于对照组；
其余各治疗的NRF2、HO-1、NQO1蛋白阳性染色均浅于空白组，深于造模组。
A.空白组;B.造模组;C.常规治疗组;D.电针干预组;E.电针治疗组;F.联合治疗组。扫描文章首页OSID码可查看彩图
2.5 电针疗法对AKI犬NRF2通路的影响
qRT-PCR和Western blot检测KEAP1、NRF2、HO-1和NQO1的基因和蛋白的表达，结果如图5、6所示，与对照组比，造模组KEAP1基因和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，而NRF2、HO-1、NQO1基因和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)；
与造模组比，各治疗组肾组织KEAP1基因和蛋白相对表达水平显著下调(P<0.01)，而NRF2、HO-1、NQO1基因和蛋白表达水平显著上调(P<0.01)。
B.空白组;M.造模组;R.常规治疗组;Ei.电针干预组;Et.电针治疗组;C.联合治疗组。对比空白组，*.P<0.01；
对比造模组，#.P<0.01
3.1 电针疗法对AKI犬肾功能的影响
现代研究证实针灸在肾疾病的治疗方面有着确切的疗效。徐艺菲等[8]报道电针可以通过改善肾微循环，增加氧和其他营养物质的供给，进而减轻肾损伤，增强肾功能。研究发现针刺还具有延缓肾损害进展、减轻肾组织损伤程度、抑制炎症反应、促进抗炎物质表达来改善肾功能[1]。肖小艳等[9]和金佳慧等[10]研究发现,刺激肾俞和关元两个穴位，肾的损伤程度明显减轻。王学杰等[11]研究证实，在肾损伤通过刺激肾俞穴能够降低尿蛋白的含量，使肾的滤过作用更快恢复。
B.空白组;M.造模组;R.常规治疗组;Ei.电针干预组;Et.电针治疗组;C.联合治疗组。对比空白组，*.P<0.01；
对比造模组，#.P<0.01
本试验选择一组经大量研究证实在肾疾病中有显著疗效的穴位配伍。其中，肾俞穴其中最主要的穴位，在治疗肾系疾病中使用频率最高，治疗效果最好，尤其在治疗肾损伤和糖尿病肾病的研究中常被选用[12-13]。中医学对于本脏的疾病优先考虑本脏的背俞穴进行治疗，以达到更好的治疗效果。因此，肾疾病首选肾俞穴进行治疗。刺激肾俞穴能够改善肾功能，促进水液运化[14-15]。脾俞穴与肾俞穴相配伍，能够在调节肾功能的同时加强脾的水液运化能力[16]。足三里穴在许多疾病的治疗和养生保健方面都有着广泛的应用，针刺其穴位能够生发脾胃之气同时增强机体的免疫力[17-18]。针灸三阴交除健脾益血外，还能调肝补肾，对于急性肾衰竭的恢复期有着较好的疗效[19]。太溪穴与肾俞穴合用称原俞配伍[20]。原俞配穴是指将脏腑所对应的原穴和背俞穴配伍使用，相比单独针灸一个穴位效果更好。因此，选用肾俞和肾经的原穴太溪相配伍[21]。此外，本试验选取的命门穴在临床上与腰、肾疾病关系密切。本试验选取命门穴与上述其他穴位合用，改善急性肾损伤犬的肾功能。同时由于犬的皮肤游离性较大，在试验操作过程中肾俞穴不方便定位。因此先定位命门穴，再沿腰椎定位肾俞穴也有利于试验过程中的操作。本试验造模组的肾较对照组出现体积增大[22]，经过电针联合治疗后，体积减少，肾病变损伤程度减轻，治疗效果比常规治疗及电针单独治疗效果好。尿酸和肌酐是判定肾损伤的主要指标。临床上也是主要根据肌酐含量来判定肾损伤程度[23]。AKI犬的最明显症状便是肾功能的损伤，其CREA、BUN、尿比重等都会出现明显的变化[24]。郭银雪等[25]报道ARF出现肾功能失常的主要原因是肾小管发生阻塞，导致有毒物质在体内蓄积。本研究发现电针治疗组及其他治疗组较造模组BUN、CREA、UA均显著降低，尿比重显著升高，且电针联合治疗组的结果比常规治疗组合电针单独治疗组低。说明电针疗法对AKI犬的肾及其功能具有积极作用。
3.2 电针疗法对AKI犬钙磷代谢的影响
在肾发生损伤过程中，血液内游离的钙通过被破坏的钙离子转运通道转移到细胞内，超过正常细胞承载能力[26]。同时，血液中磷的含量会因肾功能障碍导致磷排出困难而增加，另外组织细胞受到实质性的损伤导致细胞内的磷被释放入血，进一步导致了血磷的上升[27]。上述报道与本研究结果一致，试验造模后血清磷含量显著增加，血清钙含量显著降低。各治疗组较造模组血磷浓度显著降低，血钙浓度显著增高，其中，电针联合治疗组比常规治疗组和电针单独治疗组变化明显；
说明电针处理能够减少磷在血中的含量并提高钙的含量，从而减轻AKI引起的体内钙磷代谢失调，从而减轻组织细胞的损伤程度。
3.3 电针疗法对AKI犬抗氧化能力和NRF2通路的影响
在AKI过程中出现广泛的氧化应激损伤[28]，而氧化应激损伤也存在于AKI的致病机制之中[5]。邓树泳等[29]研究发现针刺治疗能够提高机体的免疫反应，增加体内多个免疫器官的抗氧化能力，并促进这些免疫器官中SOD的生成和MDA的减少，从而达到增强机体整体的抗氧化能力的效果。这一结论与本研究结果相一致，各治疗组相比于腺嘌呤造模组SOD均有不同程度的增强，MDA含量均有不同程度的降低，其中，联合治疗组的作用效果最明显。说明电针的干预和治疗能够提升AKI犬的抗氧化能力。
在氧化应激过程中，NRF2信号通路通过激活抗氧化酶的表达来对过量的能造成氧化损伤的物质进行清除[30-31]。NRF2信号通路被认为是最为主要的信号通路之一，NRF2也被认为是该信号通路上的核心蛋白[5,32]。NRF2进入细胞核内，启动各类抗氧化蛋白酶的翻译过程，包括NQO1、HO-1等[33-36]。也有研究证实，电针治疗能够通过调控NRF2信号通路改善机体的氧化应激水平[37-38]。上述报道与本研究结果一致，造模组KEAP1蛋白和基因的表达量升高，NRF2、NQO1、HO-1蛋白和基因表达量降低；
电针治疗组KEAP1蛋白的表达量较造模组降低，而NRF2、NQO1、HO-1蛋白的表达量较造模组增加，其中，联合治疗组的蛋白和基因表达量较造模组变化最明显。说明经电针治疗以后其NRF2通路上相关蛋白表达增加,其抗氧化能力也得到提升。
4.1电针治疗通过提高肾功能、改善钙磷代谢、提升抗氧化能力、降低肾KEAP1的表达，增加肾NRF2及其下游的抗氧化相关蛋白的表达等方面缓解犬的急性肾损伤症状，减轻肾损伤程度。
4.2电针与常规疗法相结合的联合治疗方法对于急性肾衰竭的治疗效果较好，其治疗效果优于单独使用电针治疗与单纯进行对症治疗。
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