赵庆华，路广金，邹绍林，张 冲，赵亚选，宣元元，季相山*
（1.山东省济宁市微山县畜牧兽医事业发展中心，山东 济宁 277600；
2.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安；
3.山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安）
进入21 世纪以来，研究肠道微生物已经逐渐成为全球生命科学研究领域的重点之一，人们逐渐认识到肠道微生物是人类和动物非常重要的“功能性器官”，甚至还被称为“第二大脑”，是一个信号中枢，可接收环境刺激信号（如食物）与遗传和免疫信号进行整合，继而影响宿主的新陈代谢、免疫和感染应答[1-3]。乳酸菌（Lactic acid bacterium）是肠道微生物的重要组成菌株，也是微生态制剂的重要组成菌株，包括种类较多，如戊糖片球菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌等。戊糖片球菌在2014 年被卫生部纳入可食用菌种名录。近年来，戊糖片球菌的分离来源逐渐丰富，在哺乳动物、禽类和淡水虾肠道中均证实存在[4-5]。研究表明，戊糖片球菌是肉鸡肠道内的原生微生物菌株，在肉鸡日粮中添加1.0×109～1.0×1011CFU/g戊糖片球菌可以显著提高肉鸡的饲料转化率、生长性能以及产肉性能，也可增强肉仔鸡的免疫功能[6-7]。
本实验室分离了一株戊糖片球菌PP-23，表现出良好的产乳酸性能和较好的培养性能[8]，但其在促进肉鸡生长和免疫方面的效果尚未可知。本试验旨在研究戊糖片球菌PP-23 对肉鸡早期生长性能、免疫性能及肠道形态的影响，以评价其作为饲料添加剂的潜力。
1.1 材料
试验菌株戊糖片球菌PP-23 为实验室前期分离、保存的菌株。菌体细胞呈球状，不延长，多个菌体连成一片，呈现短链球形（图1），革兰氏染色为阳性（图2）。
图1 菌落形态图
图2 菌株革兰染色结果
1.2 方法
1.2.1 试验设计 挑选健康的1 日龄的体重相近的240 只肉仔鸡，随机分为5 组，每组3 个重复，每个重复16 鸡。分别为对照C0 组：投喂基础日粮；
T1 组：持续投喂基础日粮＋1.0×107CFU/gPP-23；
T2 组：投喂基础日粮＋1.0×107CFU/gPP-23 2 周后，投喂1 周基础日粮；
T3组：持续投喂基础日粮＋1.0×108CFU/gPP-23；
T4 组：投喂基础日粮＋1.0×108CFU/gPP-23 2 周后，投喂1 周基础日粮。试验期为3 周。参照NRC《肉鸡饲养标准》配制AA 肉鸡基础试验日粮。
1.2.2 饲养管理 试验前先将所用试验用具进行清洗，鸡舍整体消毒，通风5~6 d，仔鸡进鸡舍前将室内温度升至37 ℃；
饲养过程中采用人工光照、半自动人工饮水系统，试验鸡自由采食和饮水。
1.2.3 测定指标及方法 （1）生长性能：试验期间严格记录日投料量、余料量、死淘数。试验结束后，AA 肉鸡饥饿处理12 h 后称重（FW），同时称量各组剩余饲料量计算各试验组平均日采食量（ADFI）、日增重（ADG）、料重比（F/G）。（2）屠宰性能：试验肉鸡饲养结束后禁食12 h，每个重复中随机选取2 只肉鸡称重，静脉放血处死后屠宰解剖进行称重。半净膛重：屠体重去除胰腺、肠道、气管、食道、嗉囊、脾脏、胆囊和生殖器官称重。全净膛重：半净膛去除头、心脏、肝脏、爪、腺胃、肌胃、腹脂、胫后称重。屠宰率=屠体重/活重×100 %；
半净膛率=半净膛重/活重×100 %；
全净膛率=全净膛重/活重×100 %；
取一侧胸肌和一侧腿肌称重。胸肌率=胸肌重/全净膛重×100 %；
腿肌率=腿肌重/全净膛重×100 %。肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊称重，计算免疫器官指数：免疫器官重量占鸡体重的相对重量比值（g/kg）。（3）基因表达的测定：取脾脏及空肠保存于液氮中，提取总RNA 1 % 琼脂糖凝胶电泳检测后 -80 ℃保存备用。总RNA 反转录成cDNA 后进行qRT-PCR 分析，体系组成：TB Green Premix Ex Taq 10 µl，Primer F（R）各0.4 µl，cDNA 2 µl，dd H2O 7.2 µl；
反应条件：95 ℃ 预变性30 s，1 Cycle；
95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 Cycles。所用引物见表1。使用2-∆∆CT方法进行数据分析计算免疫相关基因的相对表达量。（4）肠道组织切片制作：每个重复随机取2 只肉鸡解剖，截取鸡的十二指肠、空肠及回肠的中段各0.5 cm，1×PBS 溶液清洗后，放入3 倍体积的4 % PBS-PFA 多聚甲醛中，经脱水、包埋、切片、HE 染色、中性树脂封片后在显微镜下观察肠道组织形态。
表1 荧光定量引物信息
1.2.4 数据分析 采用Graphpad prism8.0、IBM SPSS Statis-tics 21.0 软件处理数据，利用SPSSStatistics 21（SPSS, Inc., Chicago, Illinois.）进行turkey 检验，分析各组间的差异。P＜0.05 表示差异显著。
2.1 戊糖片球菌PP-23 对AA 肉鸡生长性能的影响与C0 组相比，T1 组FW 和ADG 均显著提高，
F/G 显著降低，ADFI 差异不显著；
T2、T3 和T4组各指标均差异不显著（表2）。
表2 日粮中添加不同浓度戊糖片球菌后对肉鸡生长性能的影响
2.2 戊糖片球菌PP-23 对AA 肉鸡屠宰性能的影响
由表3 可见，与C0 组相比，T1 组半净膛率和全净膛率、T3 组全净膛率均显著升高，T2、T4 组差异不显著。所有试验组的腹脂率、胸肌率和腿肌率与对照组差异不显著。
表3 日粮中添加不同浓度戊糖片球菌对肉鸡屠宰指标的影响 （%）
2.3 戊糖片球菌PP-23 对AA 肉鸡免疫器官指数的影响
由表4 可见，与C0 组相比，T3 组法氏囊指数显著升高，T1、T2、和T4 组差异不显著。所有试验组的胸腺指数和脾脏指数与对照组均差异不显著。
表4 日粮中添加不同浓度戊糖片球菌对肉鸡免疫器官指数的影响 （g/kg）
2.4 戊糖片球菌PP-23 对AA 肉鸡脾脏和空肠免疫相关基因表达的影响
由图3 可知，与C0 组相比，除T4 组脾脏IL-1β基因与对照组差异不显著，其他组基因表达水平均显著下调。
图3 添加不同浓度戊糖片球菌对肉鸡空肠（a，b）和脾脏（c，d）免疫基因表达的影响
2.5 戊糖片球菌PP-23 对AA 肉鸡小肠形态结构的影响
由表5、图4 可见，与C0 组相比，T1 和T2 组肉鸡中十二指肠和回肠的绒毛高度显著提高，T1～T4 组空肠绒毛高度均显著提高；
T1、T2 组十二指肠的隐窝深度显著升高，T3 组回肠的隐窝深度显著降低；
T1、T2 组十二指肠绒毛宽度显著升高；
各试验组空肠绒毛宽度显著升高；
T1、T2 组空肠和回肠绒隐比显著提升；
T4组十二指肠肌层厚度显著提升，T1、T3 组空肠肌层厚度显著降低。其他指标与对照组差异不显著。
图4 各组AA 肉鸡空肠、回肠、十二指肠形态
表5 添加不同浓度戊糖片球菌PP-23 对肉鸡肠道形态的影响 （µm）
畜禽的日增重和耗料增重比是反映益生菌制剂有效性和经济性的重要指标[9]。乳酸菌是鸡肠道中的原生菌群，饲料中加入适量的乳酸菌会对动物产生有益的影响[10]。据宋小燕等[11]、ShoKryazdan 等[12]的研究，在日粮中添加乳酸菌，肉鸡的平均日增重明显升高，料重比明显降低。戊糖片球菌是乳酸菌的一种，具有促进机体吸收营养物质的作用。本试验结果表明在肉鸡日粮中添加戊糖片球菌PP-23 可以显著提高肉仔鸡的平均日增重，降低料重比。有研究发现乳酸菌对肉鸡屠宰性能影响极小或无[13]，本试验发现饲料中添加戊糖片球菌PP-23，结果显示各屠宰指标均有上升趋势但无显著性差异，这与李菊等[13]的研究相一致。
IL-1β属于白细胞介素，是一种促炎性的细胞因子，具有调节免疫系统的作用，IFN-γ是淋巴细胞分泌的具有免疫调控作用的一种糖蛋白。Ateya 等[14]在受大肠杆菌感染的肉鸡的日粮中添加益生菌、酸化剂和共生菌可以降低回肠IL-1β的表达；
Han[15]在肉鸡日粮中补充戊糖片球菌，发现其回肠中IL-1β表达的下调。本试验研究也表明PP-23 能使肉鸡空肠中IL-1β的表达显著降低（P＜0.05），各试验组空肠中IFN-γ的表达量显著下调（P＜0.05）。说明戊糖片球菌可以通过调节IL-1β和IFN-γ的表达调节动物免疫力。脾脏、胸腺和法氏囊是家禽的主要免疫器官，其免疫器官重量的增长可以直接用于评价肉鸡的免疫状况[16]。大量研究表明乳酸菌能够促进免疫器官的生长，提高免疫器官指数。研究发现，在肉鸡日粮中添加乳酸菌制剂可以提高鸡的脾脏、法氏囊和胸腺指数[17-18]。本试验结果表明在肉鸡饲料中添加戊糖片球菌PP-23，可以提高脾脏、胸腺和法氏囊指数，提高机体免疫力。
肠道绒毛高度、隐窝深度和绒/隐比是衡量肠道吸收能力的重要指标。绒毛的高度与肠道吸收营养的能力成正比，绒毛越高吸收能力强，相反则吸收能力差。研究发现益生菌可以调控肠道微生物菌群，进而影响肠道屏障的功能和发育，从而提高肉鸡小肠的绒毛高度[19]。王磊等[20]在基础日粮中添加2×106CFU/kg 的复合益生菌（乳酸菌+枯草芽孢杆菌），肉鸡回肠的隐窝深度和绒毛高度都显著提高；
史洪涛[21]在817 肉鸡日粮中添加乳酸菌，结果显示能够明显的提高817 肉鸡小肠的绒毛高度、降低隐窝深度，从而使绒/隐比升高。本实验研究表明在AA 肉鸡饲料中添加戊糖片球菌PP-23 可提高肠道绒毛高度、隐窝深度和绒/隐比。这些指标的增加表明肠道可更好地吸收营养物质[22]，从而提高肉鸡的生长性能。
本试验结果显示，在AA 肉鸡日粮中添加戊糖片球菌PP-23 可显著提升肉鸡的生长速度，并能增强肉鸡的免疫性能，适宜添加浓度为1.0×107CFU/g，最佳饲喂方式是持续饲喂。
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