徐 炜，张玉磊，施 妍，方媛媛，欧阳斌斌，张文立，沐万孟*，2
（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；
2.江南大学 食品安全国际合作联合实验室，江苏 无锡 214122）
真菌毒素的发现要追溯到11 世纪欧洲的 “麦角中毒”事件。真菌毒素主要是由丝状真菌如镰刀菌属、曲霉属和青霉菌属产生的次生代谢物。真菌毒素一般理化性质稳定，结构难以破坏，可以通过食物链进行累计富集，从而危害到动物和人类的健康安全，产生一系列的生殖毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌毒性。例如玉米赤霉烯酮被证明具有肝毒性、血液毒性、生殖毒性、免疫毒性和遗传毒性。谷物、种子和水果中存在真菌毒素会造成巨大的经济损失，并对农业和食物链构成重大威胁，进而对人类健康构成威胁。据联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）的调查显示，世界上每年约有25%的农作物被真菌毒素污染，给全球造成了近千亿美元的经济损失[1]。早在2006 年，欧盟（European Union，EU）就实施了食品真菌毒素法规委员会条例并且对食品中真菌毒素的最高含量进行了明确规定。因此，如何最大限度地减少真菌毒素一直是饲料和食品行业的一个重要且全球性的话题。
物理方法可以去除一些真菌毒素，但必需营养素的非特异性结合禁止其进一步应用。由于潜在的毒性、较高的成本和可能的二次污染，化学方法也受到限制。近年来，生物脱毒相比于物理化学法愈加展现其强大的优势，其中的生物酶法脱毒更是吸引了广泛的关注。生物酶法在仅添加蛋白质及少量绿色因子的情况下，便能够高效降解真菌毒素，降解程度高，且最终产生的转化产物毒性更低。基于此，作者对呕吐毒素、玉米赤酶烯酮、黄曲霉毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、展青霉毒素6 种常见真菌毒素的降解酶及其在饲料与食品行业中的研究现状进行了综述（见图1）。
图1 真菌毒素降解酶从“实验”走向“实际”Fig.1 Mycotoxins degrading enzymes from "laboratory" to "practice"
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素，因其会引起人类和动物的腹泻、呕吐和胃肠道炎症而得名。低剂量的DON 摄入会造成动物的肠道屏障损伤和免疫刺激，高剂量摄入时会引起呕吐，导致饲料转化率降低等。能够产生呕吐毒素的菌属主要包括链孢菌属（Alternaria Nees）、曲霉属（Aspergillus）、枝孢菌属（Cladosporium）、镰刀菌属（Fusarium）和青霉属（Penicillium）[2]，其中镰刀菌属是最主要的菌属。DON 通常在农作物采后和储存过程中产生，常出现于世界各地被污染的食品和饲料中，尤其在玉米中的发生率较高。
由于很难在农作物生长环节中完全避免DON的产生，因此近年来人们围绕作物加工和储存环节开展了一系列有关DON 解毒的工作。目前，利用微生物吸附、降解或使用酶法降解对DON 进行生物解毒，具有巨大的应用潜力。其中，酶法降解DON因反应条件温和、降解率高等优点备受关注。研究报道，DON 中主要的致毒基团是C3 位的羟基和C12～C13 位的环氧结构（见图2）[3-4]。因此酶法消除DON 的主要作用位点是C3 羟基以及C12～C13 位的环氧基团[5]。
图2 呕吐毒素的结构简式及相应的酶解基团Fig.2 Chemical structure of DON and the corresponding degradation groups
1.1 C12～C13 环氧结构的DON 降解
有关DON 的C12～C13 环氧结构的降解或修饰作用的降解酶鲜有报道。其中，来自米曲霉（Aspergillus oryzae）As-W.6 的培养液被发现含有一种脂肪酶，且纯化后的脂肪酶可以将不同浓度的DON 降解70%[6]。高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）分析结果显示，降解产物比DON 的相对分子质量减少了13.9，表明生成了一种新的物质。尽管对C12～C13 环氧结构进行降解的酶报道很少，但作用于该位置的DON 降解菌却很多。如Fuchs 等发现从牛瘤胃分离的细菌菌株BBSH 797 可以将DON 降解为DOM-1；
不但如此，与DON 结构类似的6 种不同的A 型毛霉烯族毒素液均能被该菌株降解[7]。Gao等从鸡肠道中鉴定出一株新的毛霉烯氧化细菌Eggerthella sp.DII-9。在温度20～45 ℃和pH 5～10时，该菌生长状态良好，并能够将DON 转化为DOM-1，且同样对之前提到的DON 同族毒素具有光谱降解效果[8]。该团队还筛选得到一株革兰氏阳性无孢子菌Slackia sp.D-G6，该菌株不仅可以将DON 降解为DOM-1，还可以高效的产生雌激素，能有效预防雌激素依赖以及年龄相关的疾病[9]。
1.2 C3 位羟基的DON 降解
针对DON 的C3 位羟基有两种降解的途径。一种是氧化C3 位羟基，生成相应的酮基，即3-酮-DON（3-keto-DON）；
另一种是将C3 位羟基异构化，形成3-羟基-DON（3-epi-DON）。He 等从麦田中分离到一株能够降解DON 的细菌菌株鞘氨醇单胞菌S3-4（Sphingomonas S3-4）[10]。通过与其他可降解DON 菌株的基因组序列进行比较分析，结合鞘氨醇单胞菌S3-4 基因组BAC 文库的功能筛选，发现鞘氨醇单胞菌S3-4 菌株中主要是一个羟酮还原酶家族成员AKR18A1 负责将DON 氧化为3-keto-DON。随后该酶成功在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现重组表达，重组后的AKR18A1 降解DON 的最适pH 为9.5，在此条件下该酶的最大反应速率为（25.7±0.8）nmol/（min·mg）。该酶在pH 10～11 时可以保持70%的相对酶活力，显示出良好的碱稳定性。AKR18A1 的降解反应依赖辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+），但是在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）存在的情况下，AKR18A1 也能够催化3-keto-DON 的逆反应生成DON。随后，He 等发现德沃斯氏菌D6-9（Devosia mutans D6-9）能够将DON分解为3-keto-DON 和3-epi-DON。通过对德沃斯氏菌D6-9 进行基因组分析，共确定了3 个与DON异构化反应有关的基因，其编码的蛋白质一个是醌依赖的DON 脱氢酶QDDH，负责将DON 氧化为3-keto-DON[11]，以及另外两个分别为NADPH 依赖的aldo/keto 还原酶AKR13B2 和AKR6D1，负责将3-keto-DON 转化为3-epi-DON。利用大肠杆菌获得重组蛋白质QDDH、AKR13B2 和AKR6D1，并对小麦籽粒中的DON 进行降解，可以观察到6 h 内DON 被完全降解成3-keto-DON 和3-epi-DON。Carere 等通过对DON 降解菌德沃斯氏菌17-2-E-8（Devosia mutans 17-2-E-8）的RNA 进行测序和比较，推测该菌株中可能同时存在两种DON 降解酶。一种是吡咯喹啉醌（PQQ）依赖的脱氢酶DepA，可以将DON 降解为3-keto-DON。另外一种蛋白酶则负责将3-keto-DON 进一步还原为3-epi-DON[12]。随后，又在Devosia mutans 17-2-E-8 中纯化出了DepB，证实了DepB 是一种NADPH 依赖的脱氢酶，该酶的最适温度为30 ℃，最适pH 为7.5，且在pH为7～8 时能够保持较高的降解率[13]。
Qin 等通过对耐盐远洋杆菌 ANSP101（Pelagibacterium halotolerans ANSP101）、德沃斯氏菌17-2-E-8 和德沃斯氏菌IFO13580 三株菌进行基因组分析，发现一种来自耐盐远洋杆菌ANSP101的喹诺酮类蛋白质，并命名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱氢酶（DDH）[14]。DDH 可以在氢受体吩嗪甲硫酸酯（PMS）或二氯酚苯酚（DCPIP）为辅因子的前体下将DON 氧化成3-keto-DON。通过与德沃斯氏菌17-2-E-8 和德沃斯氏菌D6-9 的醌依赖脱氢酶DepA序列比对，发现了DDH 中两个显著影响DON 降解的关键氨基酸残基，分别为第478 位的丝氨酸和第480 位的谷氨酸。徐建宏等研究了DON 降解菌Devosia sp.DDS-1 产生的3-乙酰-DON（3-ACDON）氧化酶的酶学特性。该酶的最适温度为35 ℃，最适pH 为7.0，且在pH 为7～9 时可以保持80%的相对酶活力。同时，结果表明大多数金属离子在浓度为0.2～2.0 mmol/L 时，对3-AC-DON 氧化酶有促进作用，而乙二胺四乙酸（EDTA）对该酶活性有抑制作用[15]。不同微生物来源的DON 降解酶及性质比较如表1 所示[10-15]。
表1 不同微生物来源的DON 降解酶及其性质比较Table 1 Comparison of DON degradation enzymes from different microorganisms and their properties
玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是一类由镰刀菌属（Fusarium）产生的真菌毒素，广泛分布于种植玉米、小麦、大麦和高粱的农田及粮食副产品中，会导致农作物的大量减产[16-17]。ZEN 具有一个二羟基苯甲酸内酯结构，并且根据其内酯环结构中C1和C6 位的官能团差异，ZEN 还拥有另外5 种结构衍生物，分别包括α/β-玉米赤霉烯醇（α/βzearalenol，α/β -ZOL）、α/β-玉米赤霉醇（α/β -zearalanol，α/β-ZAL）和玉米赤霉酮（zearalanone，ZAN），其中α-ZOL 和α-ZAL 具有比ZEN 更高的毒性。随着食物链的不断累积，ZEN 及其衍生物不仅会造成严重的农作物污染，而且严重威胁到人类的身体健康，构成了世界性食品安全问题[18-19]。作为一种真菌毒素，ZEN 已经被证明具有肝毒性、血液毒性、免疫毒性和遗传毒性。Gao 等通过小鼠实验表明接触ZEN 会破坏通过激素相关基因调节的生殖激素和睾丸发育的系统[20]。目前围绕ZEN 的降解思路主要是利用内酯酶或漆酶破坏ZEN 的内酯结构，辅以C6’酮基和C2 或C4 羟基的氧化或修饰（见图3）。
图3 玉米赤酶烯酮的结构简式及相应的酶解基团Fig.3 Chemical structure of ZEN and the corresponding depradation groups
2.1 内酯酶对ZEN 的降解
2002 年，有研究者在粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）IFO 7063 中发现了一段能够降解ZEN 的关键基因，并成功纯化到了该基因编码的目的蛋白质。然后，基于纯化蛋白质的序列，将该基因克隆到大肠杆菌中，并命名为ZHD101[21]。随后，ZHD101 分别在裂殖酵母（Schizwosaccharomyces pombe）和毕赤酵母中成功实现异源表达，并且检测到了ZEN 降解活性。这是首次报道的ZEN 降解酶，并且该基因序列早在2002 年已经被申请专利保护。随后，将增强型绿色荧光蛋白质（EGFP）基因与ZHD101 融合并在大肠杆菌中表达，并观测到表达后的重组蛋白质（EGFP：ZHD101）与改造前的ZHD101 降解效果接近。同时，在不同的pH 条件下，EGFP：ZHD101 的荧光强度和反应速度表现出良好的相关性，为实现实时检测ZHD101 体内降解ZEN 的效率提供了一定的研究思路[22]。Yang 等通过将编码ZHD101 的基因克隆到大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体pNZ3004中，然后通过电穿孔获得重组质粒pNZ-ZHD101，将重组质粒导入到从肉鸡胃肠道分离的益生菌乳酸杆菌中，结果发现转化后的菌株获得了降解ZEN的能力[23]。值得注意的是，重组ZHD101 在生产过程中并没有对细胞生长、耐酸性和胆盐耐受性产生明显的副作用。
随着研究的不断深入，其他微生物中也陆续发现了潜在的ZEN 内酯酶。如Zhang 等从红粘帚霉（Gliocladium roseum）克隆得到了一种内酯酶可以高效地降解ZEN，命名为ZENG[24]。重组ZENG 的最适pH 为7.0，最适温度为38 ℃，同时ZENG 对ZEN、α-ZOL 和α-ZAL 都有较高的降解率。Hui 等挖掘出了一种ZHD101 同源的蛋白质，称为CbZHD。序列比对表明，CbZHD 具有与ZHD101 相同的催化三联体“S-H-E”，而催化三联体主要用于和ZEN 之间的相互作用。CbZHD 的最适温度和最适pH 分别为35 ℃和8.0[25]。Zhang 等发现了3 种新的具有降解ZEN 能力的内酯酶CLA、EXO 和TRI，分别与ZHD101 有着61%、63%和97%的氨基酸同源性[26]。Bi 等鉴定了一种红面包霉菌（Neurospora crassa）来源的内酯酶ZENC，具有较高的酶活力。除此之外还将ZENC 应用于3 种不同的动物饲料中。结果表明，当分别在酒糟、玉米副产物和玉米皮中添加800 U 的ZENC 时，ZEN 的浓度分别降低了70.9%、88.9%和94.7%[27]。Yu 等分离了一种新的内酯酶ZHD607，并通过结构和序列比对分析，得到了活性分别是ZHD607 的2.9 倍和3.4 倍的突变体[28]。Wang 等纯化重组了一种与ZHD101 有65%的氨基酸同源性的内酯酶ZHD518，可以降解ZEN 及其衍生物等多种真菌毒素[29]。随后，对其进行了酶学性质的鉴定和活性位点改造，并设计定点突变株N156H，该突变体对α-ZOL 的降解活性提高至原始酶的3.3 倍。
2.2 其他酶对ZEN 的降解
Wang 等首次研究了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）来源的BsCotA 漆酶降解ZEN 和AFB1的能力[30]。在以丁香酸甲酯作为介质时，该酶对ZEN 和AFB1降解率分别为98%和100%。Loi 等在体外实验中评估了杏鲍菇（Pleurotus eryngii）来源的漆酶（Ery4）和漆酶介体系统（LMSs）对多种毒素的降解作 用[31]。其中，AFB1和ZEN在一起 降解时，P.eryngii Ery4 对这两种毒素的降解率分别为86%和100%。Yu 等克隆了来自不动杆菌SM04 中的一个过氧化还原酶（Prx）基因，并成功在大肠杆菌BL21中实现了重组表达[32]。重组的Prx 在H2O2存在时可以有效降解ZEN，同时对ZEN 的最适降解pH 和降解温度分别为9.0 和70 ℃。将该酶与H2O2共处理6 h 后，可以降解90%的ZEN。Qin 等鉴定出了一种来自热羧链霉菌（Streptomyces thermocarboxydus）的多铜氧化酶（StMCO）[33]。StMCO 在与乙酰丁香酮或ABTS 等介体物质共存时对ZEN 和AFB1有较高的降解率。同时，在没有介质的情况下，StMCO 也可以微弱地降解ZEN 和黄曲霉毒素AFB1。不同微生物来源的ZEN 降解酶及性质比较如表2 所示[16，21，24-33]。
表2 不同微生物来源的ZEN 降解酶及其性质比较Table 2 Comparison of ZEN degradation enzymes from different microorganisms and their properties
AFs 是由黄曲霉属菌（Aspergillus section Flavi）产生的次级代谢物[34]，在农产品加工、运输和储存以及食品加工过程中广泛存在。早在2002 年，AFs 就被国际癌症研究机构（IARC）归纳成一类致癌物。AFs 的存在不仅污染了多种食品和饲料产品[35]，而且造成严重的食品安全问题和巨大的经济损失[36]。在众多AFs 中（见图4），AFB1被研究得最为广泛，因此作者将主要围绕AFB1的几种生物降解酶进行介绍。
图4 二氢吡喃环型黄曲霉毒素及环戊烯型黄曲霉毒素的结构简式及相应的酶解基团Fig.4 Chemical structure of ciclopentenone and difurocoumarolactone and the functional group corresponding degradation groups
3.1 漆酶对AFB1 的降解
Alberts 等首次探究了白腐真菌来源的漆酶（LSs）应用不同介质降解AFB1的情况[37]。用1 U/mL的商品制剂处理，30 ℃反应3 d 后，底物AFB1的降解率为87.34%。Loi 等利用从平菇中纯化到的漆酶Lac2 去直接氧化AFB1，发现单独存在Lac2 的情况下，最终的降解率为23%。当在体系中添加乙酰丁香酮（AS）和2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）等氧化还原介体物质时，Lac2 对AFB1的降解率可以大幅提高。其中，添加1 mmol/L 的AS或ABTS 后AFB1的降解率分别从23%提升至42%和45%。值得注意的是，当丁香醛（SA）添加量为1 mmol/L 时，Lac2 的降解率与没有添加介体物质相比，降低了13%。继续提高介体物质的浓度，当添加10 mmol/L 的ABTS、AS 和SA 后，Lac2 对AFB1的降解率又分别提高到了81%、90%和72%[38]。Guo 等分离了地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）ANSB821 来源的漆酶CotA。通过研究发现，CotA 可以在没有介体的情况下实现对AFB1的高效降解，在pH 8.0 和37 ℃下，酶解3 h 和12 h 对AFB1的降解率分别为66%和96%，同时降解产物被鉴定为AFQ1和epi-AFQ1[39]。
3.2 其他酶对AFB1 的降解
刘大岭等首次报道了一种名为ADTZ 的黄曲霉毒素降解酶[40-41]。随着研究不断深入，ADTZ 被证明为氧化酶，并更名为AFO[42]。1 mg/mL 的AFO 在28 ℃、30 min 内可以 完全降 解150 ng 的AFB1。Wang 等在原毛平革菌（Phanerochaete sordida）中分离出一种锰过氧化物酶（MnP），当AFB1质量浓度为0.3 μg/mL 时，该酶可以在24 h 内将AFB1降解至14%[43]。Yehia 等同样报道了MnP 对AFB1的降解，通过在白腐食用菌平菇培养滤液中纯化分离到的MnP，与底物AFB1反应48 h 后可以达到90%的降解率[44]。Xia 等在食品级宿主乳克鲁维酵母菌GG7993 中构建了3 种不同来源的重组MnP，并通过优化找出了其中降解AFB1效率较高的PHCMNP。含有该酶的重组菌株GG799（pKLAC1 Phcmnp）培养上清液可以对花生样品AFB1的降解率达90%以上[45]。
Yang 等将变色栓菌（Trametes versicolor）来 源的AFB1降解酶（TV-AFB1D）基因整合到巴斯德毕赤酵母GS115（Pichia pastoris GS115）基因组上，并通过优化最适作用条件对AFB1的降解达到75.9%[46]。Xu 等从玉米、水稻和土壤样本中富集到的43 个细菌中成功筛选得到一株具有高效降解AFB1能力的菌株，即沙氏芽孢杆菌L7（Bacillus shackletonii L7）[47]。通过分离纯化，鉴定出沙门氏菌L7 中含有的AFB1降解酶BADH，该酶的最适温度高达70 ℃。同时发现Cu2+能够显著促进BADE 活性，而Zn2+、Mn2+、Mg2+、Li+等离子则会强烈抑制BADE 的活性[47]。Shu等分离到一株芽孢杆菌（Bacillus velezensis DY3108），并发现其对AFB1具有很高的降解率（91.5%），且发挥降解功能的主要成分是该菌的无细胞上清液[48]。用该上清液处理AFB1的最适温度和pH 分别为80 ℃和8.0。Xie 等从泛菌（Pantoea sp.T6）中分离出一种外膜蛋白质PADE，发现PADE 可以降解AFB1，反应的最适温度为40 ℃，最适pH为7.0[49]。Song 等研究了铜绿假单胞菌M19（Pseudomonas aeruginosa M19）对黄曲霉毒素B1的生物降解，并鉴定出降解AFB1的关键蛋白质PADE[50]。Li 等报道了一种F420H2 依赖的还原酶MSMEG5998 可以降解AFB1，并且发现将该蛋白质的硫氧还蛋白质（Trx）连接可以大幅增强酶的降解活性，Trx 连接的酶在8 h 内对AFB1的降解率超过80%[51]。Loi 等鉴定了一种过氧化物酶Rh_DypB，该酶可以高效降解AFB1，在低酶量和低H2O2作用下即可催化AFB1羟基化为AFQ1[52]。不同微生物来源的AFB1降解酶及其性质如表3 所示[16，33,37-39,42-47,50-53]。
表3 不同微生物来源的AFB1 降解酶及其性质比较Table 3 Comparison of AFT degradation enzymes from different microorganisms and their properties
续表3
展青霉毒素（patulin，PAT），又称棒曲霉毒素，主要是由青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）等真菌产生的一种耐热的真菌毒素（见图5），常见于植物中，且主要污染的农作物是苹果。毒性研究表明，PAT 对小鼠具有致畸、致癌和免疫毒性。除此以外，PAT 还会影响人类的免疫、神经和胃肠道系统[54]。它是苹果和苹果衍生产品（如果汁、苹果酒、果酱和其他儿童食品）中最常见的真菌毒素。生化研究表明，生物合成途径由大约10 个步骤组成。其中涉及的基因包括特征酶、调节因子和转运蛋白基因[55]。因为其污染范围广和有动物毒性的特点，挖掘PAT 相关的降解酶来保障苹果及其他果蔬作物的安全性具有重要的研究价值。
图5 展青酶毒素的结构简式及相应的酶解基团Fig.5 Chemical structure of patulin and the corresponding degradation groups
关于展青霉素降解酶的挖掘，Tang 等报道了来自粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）中的磷酸核糖基转移酶Orotate 对苹果汁中棒曲霉毒素具有降解作用，通过研究苹果汁中棒曲霉毒素降解前后的最佳降解条件和理化性质的变化发现，苹果汁中除了香气成分和抗坏血酸成分发生一定变化外，酶降解后的其余各项理化性质均无显著差异[56]。Wang 等研究了卡利比克毕赤酵母（Pichia caribbica）降解PAT 的机理并发现了其关键基因翻译的PcCRG1蛋白质，最终体外实验证实了PcCRG1 蛋白质对PAT 的降解能力[57]。Xiao 等研究了猪胰脂肪酶（PPL）对梨汁中PAT 的降解能力以及降解后对梨汁品质参数的影响[58]。通过优化不同的PPL 用量、温度和时间，最终得出了PPL 的最佳脱毒条件：当PPL的质量浓度为0.02 g/mL 时，能够降解0.375 mg/L的PAT，且降解率可达到93.4%。同时，还评价了PPL 水解对梨汁中不同风味物质的影响，发现PPL的酶解不会对有机酸和维生素C 等风味物质产生明显的改变。Xing 等从阴沟肠杆菌TT-09（Enterobacter cloacae TT-09）中分离鉴定出一种核糖核苷二磷酸还原酶NrdA 同样对棒曲霉毒素起关键的降解作用[59]。Xing 等继续从酵母菌株（Candida guilliermondii）中分离出短链脱氢酶（CgSDR）基因，并将其翻译出的蛋白质SDR 成功在大肠杆菌中异源表达和生产[60]。Dor 等纯化出一种PLL 家族的乳糖酶，该酶被发现可以显著抑制病原菌在苹果中的定殖[61]。此外，如果在病原菌感染苹果之前将纯化的乳糖酶添加到菌培养物中，会导致致病菌中参与PAT 生物合成和真菌细胞壁生物合成的关键基因表达量明显减少。不同微生物来源的PAT 降解酶及其性质如表4 所示[56-58，60]。
表4 不同微生物来源的PAT 降解酶及其性质比较Table 4 Comparison of PAT degradation enzymes from different microorganisms and their properties
伏马毒素（fumonisins，FB）于1988 年首次从串珠镰刀菌培养液中分离发现。它是滋生在谷物上的轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）、串珠镰刀菌（Fusarium monitiforme）等多种镰刀菌属真菌产生的具有水溶性的次级代谢产物。此外部分曲霉菌和弯颈霉菌也被报道会产生伏马毒素，如黑曲霉能在花生、玉米、葡萄等多种农作物中产生伏马毒素[62]。天然伏马毒素是由丙烷-1，2，3-三羧酸和长链氨基多元醇骨架组成的二酯，根据多氢醇的不同，这类真菌毒素可以分为A、B、C、P 4 个系列共28 种不同形式的伏马毒素，其中B 系列（FB1）占70%[2，63]，是污染分布最广、毒性最强、研究最为广泛的一种，并且常与其他系列的伏马毒素（FB2、FB3）共存[64]。伏马毒素的存在，严重影响包括玉米、小麦、燕麦在内的多种谷物及谷物制品的安全性，对人类和动物的健康造成巨大威胁。伏马毒素残留在食物中进入人体，损害人体肝肾功能，刺激和抑制人体免疫系统，会导致食道癌、肝癌等多种疾病。根据Qu 等的研究，伏马毒素的致毒机理是调节鞘脂代谢和诱导氧化应激效应[65]。伏马毒素作为二酯化合物，是人体内两种鞘脂——二氢神经鞘氨醇（SA）和神经鞘氨醇（SO）的结构类似物，而高浓度的FB 会对神经酰胺合成酶产生抑制作用[66]，扰乱鞘磷脂代谢，导致人体细胞和组织内的鞘氨醇累积，最终产生致毒效果[67]。根据联合国粮食及农业组织和世界卫生组织规定，伏马毒素的每日最大耐受水平为2 μg/kg（以体质量计）[65]。针对伏马毒素污染的控制，主要通过作物收获前引入预防镰刀菌措施进行拮抗，以及农作物收获后在加工过程中使用天然的黏土吸附剂对FB 进行吸附。但是，上述两种方法均无法彻底达到解毒的效果，并且会残留其他物质，因此利用生物酶法进行高效彻底地降解FB（见图6）具有重要的研究价值。
图6 伏马毒素的结构简式及相应的酶解基团Fig.6 Chemical structure of fumonisins and the corresponding degradation groups
关于FB 降解酶的挖掘与应用，目前所报道的真菌毒素降解酶及降解菌均较少，只有少数降解酶被鉴定。FB 降解酶主要为羧酸酯酶，Duvick 等首先在Exophiala spinifera 中发现了负责降解伏马毒素的关键基因，将这些基因簇在玉米等农作物中克隆表达后，伏马毒素的含量逐渐减少[68]。Heinl 等研究发现菌株Sphingopyxis sp.MTA144 中存在两步酶促反应将FB1降解为无毒产物。首先，由基因fumD编码羧酸酯酶催化水解主链上C14 和C5 两个三羧酸基团并生成中间产物HFB1；
其次，由基因fumI 编码的氨基转移酶将HFB1的C2-氨基转移到底物丙酮酸上，得到终产物2-keto-HFB1。对比2-keto-HFB1与FB1的关键致毒基团，发现最大的变化是在致毒氨基基团，因此，作者推测该两步反应的终产物无毒[69]。Doris 等在以上工作的基础上，实现FumI（GenBank ACS27061）在大肠杆菌中的异源表达。通过纯化并鉴定了该酶的最适反应条件为pH 8.5 和35 ℃，同时发现磷酸吡哆醛可提高酶活力，而高浓度盐则会抑制酶活性[70]。除了羧酸酯酶，Li 等根据氨基酸序列同源性、微生物来源和蛋白质结构，利用生物信息学技术从GenBank 中筛选出一种来自鞘氨醇单胞菌属的羧酸酯酶（FumDSB）。FumDSB 有着与FumD 相似的作用机制，且可将FB1降解为HFB1（毒性仅为母本化合物的1/10），该酶在最适条件pH 6.0、30 ℃下的比活力可达1.12 U/mg，同时具有良好的pH 和热稳定性[71]。Garnham 等从黑曲霉中分离鉴定了一种单胺氧化酶AnFAO，并且发现AnFAO 可以将FB2氧化脱胺形成FPy2。随后，成功在大肠杆菌中实现AnFAO 的重组表达，并且结果显示在不需要添加外源辅因子的前体下，AnFAO 就能将伏马毒素FB2氧化脱胺[72]。有学者已于2014 年首次将来自Sphingopyxis sp.MTA144 的天然酯酶开发为商用FB 脱毒酶制剂FUMzyme，这是第一个经欧盟认证能够将FB 生物转化为无毒产物的安全酶制剂[73]。Alberts 等以商品化酶制剂FUMzyme 为基础，开发出一种FumDFB 还原法，可以进一步扩大该酶制剂在整粒燕麦中的应用[74]。不同微生物来源的FB 降解酶及其性质如表5 所示[69-72]。
表5 不同微生物来源的FB 降解酶及其性质比较Table 5 Comparison of FB degradation enzymes from different microorganisms and their properties
赭曲霉毒素（ochratoxin，OT）主要由赭曲霉属和数种青霉属真菌产生，其衍生物包括A（OTA，见图7）、B（OTB）、C（OTC）和α（OTα），其中OTA 毒性最强，污染最严重，在小麦、玉米、花生等农作物中均可广泛检出OT。赭曲霉毒素骨架均由二氢异香豆素基团和苯丙氨酸以酰胺键连接而成，此外OTA 和OTC 还包含一个对氯苯酚结构[75]。OTA 是一种白色、无臭、热力学性质稳定的固体结晶物，水溶性差，溶解于醇、酮和氯仿等有机溶剂。因其特殊的化学结构特征，OTA 具有很强的荧光特性，即经紫外线照射会呈现绿色荧光[76]。OTA 在酸性条件下极为稳定，同时食品加工中的简单高温处理并不能将其去除。OTA 具有免疫毒性、遗传毒性、神经毒性和致畸性，而其脂溶性使之易于在动物的组织中积累，进一步通过食物链被人类摄入。OTA 的结构还类似于人体必需氨基酸苯丙氨酸，因而会竞争性抑制肝肾中的苯丙氨酸羟化酶的作用，抑制相应蛋白质的合成[77]。包括中国在内的多个国家和地区均对OTA检出做限量规定：根据GB 2761—2011，我国各类谷物和豆制品中的OTA 限量为5 μg/kg[78]。欧盟在部分食品中设定了OTA 限值，为5～50 μg/kg[79]。通过酶促反应降解OTA 具有特异性强、降解率高等特点，是目前生物脱OTA 的一大研究热点。OTA 的酶促降解途径主要有如下4 种：1）水解酰胺键裂解生成OTα 和L-β-苯丙氨酸；
2）异香豆素环脱氯生成OTB，并进一步降解为OTβ；
3）异香豆素环羟基化生成赭曲霉毒素对苯二酚（OTHQ）；
4）内断裂酯环生成OTA 内酯OP-OTA（与OTA 具有相似毒性）。由于L-β-苯丙氨酸被认为是一种无毒化合物，且OTα的半衰期仅为OTA 的1/10，因此水解酰胺键生成OTα 和L-β-苯丙氨酸被认为是真正实现了OTA 的解毒[80]。
图7 赭曲霉毒素A 的结构简式及相应的酶解基团Fig.7 Chemical structure of ochratoxin A and the corresponding degradation groups
6.1 肽酶降解OTA
赭曲霉降解酶主要分为Zn2+依赖的金属羧肽酶CPA（EC 3.4.24）和丝氨酸羧肽酶CPY（EC 3.4.16）。Pitout 等证实从牛胰腺中分离出来的羧肽酶CPA 可以水解OTA，在25 ℃下的Km值为1.5×10-4mol/L[81]。来自酿酒酵母的羧肽酶CPY 也被发现可以降解OTA 为OTα，且最适作用条件为pH 5.6 和37 ℃，但该酶的活性较低，经过5 d 的孵育后，对OTA 的降解率仅有52%[82]。Zhang 等从粪产碱菌DSM 16503（Alcaligenes faecalis DSM 16503）中纯化 出一种OTA 降解酶Af-OTase（GenBank OSZ37025.1）。经鉴定该酶属于M20 肽酶家族，在其活性部位含有两个Zn2+，属于Zn2+依赖酶。该酶在pH 6.5、50 ℃的条件下达到最佳降解效果，并且表现出良好的pH 稳定性和热稳定性[83]。除此之外，有关OTA 降解酶的分子改造也取得了一定的效果。Azam 等利用基因融合技术，构建了含有玉米赤霉烯酮水解酶ZHD（GenBank AB076037）和羧肽 酶 CP（GenBank KP161493）的融合酶ZHDCP。该酶具有协同降解OTA 和ZEN 的双功能活性，且在pH 7.0 和30 ℃下，仅反应30 min 便可以完全降解OTA[84]。Xiong 等构建了截断前肽和信号肽的成熟CPA 突变体（MCPA）。结果表明，突变体M-CPA 对OTA 的降解率可达93.36%，较原始酶有了大幅提升[85]。
6.2 其他降解酶
宋佳等同样从粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）中分离出一种Co2+和Zn2+依赖的酰胺水解酶，命名为Af-OTd（GenBank：WP_123049291.1），且成功实现了该酶在大肠杆菌的异源表达。经纯化鉴定，该酶的最适反应条件为pH 7.5、50 ℃，且在此条件下，该酶对OTA 具有90%以上的降解率[86]。Dobritzsch 等报道了一种来自黑曲霉的OTA 降解酶（登录号AAG60585），并命名为OTase，测得该酶的最适反应条件为pH 6.0 和60 ℃[87]。Luo 等从嗜酸窄食单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）中分离出一种能够高效降解OTA 的酰胺水解酶ADH3（GenBank CP062156.1），重组的ADH3（1.2 mg/mL）可以在90 s 内完全去除OTA（50 mg/mL），且具有较强温度适应性，在0～70 ℃均能发挥一定水解作用[80]。一些其他种类的酶，如脂肪酶、酰胺酶和蛋白酶也被发现能够水解OTA。如来自黑曲霉的脂肪酶与50 μg/mL的OTA 反应120 min 后，后者被100%降解为OTα和苯丙氨酸[88]。一些商业上的蛋白酶也可被报道可以将OTA 水解为OTα，如来自黑曲霉的蛋白酶A和来自猪胰脏的胰腺素。这些酶均在pH 7.5 显示出很高的水解活性，在与底物反应25 h 后可以将1 μg/mL 的OTA 分别降解87.3%和43.4%[89]。Garcia等研究了商业化的过氧化物酶POD 对模型溶液和实际啤酒中的OTA 降解效果，发现降解率分别为64.9%和10.9%[90]。不同微生物来源的OTA 降解酶及其性质如表6 所示[80-84,86]。
表6 不同微生物来源的OTA 降解酶及其性质比较Table 6 Comparison of OTA degradation enzymes from different microorganisms and their properties
尽管目前已鉴定的真菌毒素降解酶种类已经覆盖到了包括辣根过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、羧肽酶、脂肪酶、酰胺酶、醌依赖性脱氢酶、醛酮还原酶和UDP-糖基转移酶和内酯水解酶等在内的超10 种生物酶，但是针对真菌毒素降解菌中的特定降解酶鉴定和报道仍然不足。例如，从牛瘤胃液中分离出的真杆菌（Biomin®BBSH 797）培养物能够将DON 转化为DOM-1，但尚未确定负责这种单端孢菌素降解的特定酶是什么。因此增加真菌毒素代谢物或中间体的组分探究和结构分析对于揭示微生物中的特定降解酶至关重要。其次，真菌毒素降解酶的大规模实际应用需要满足几点要求，包括安全性好、有效性高、生产成本低，以及良好的温度、pH和有机溶剂耐受性。然而，只有少数天然酶能够满足这些需求。针对真菌毒素降解酶的分子改造已初见成效，如融合表达玉米赤酶烯酮降解酶ZHD101和锰过氧化物酶PHCMNP 对AFB1和ZEN 显示出良好的协同降解能力。然而，目前已知的ZEN 或DON 等真菌毒素降解酶的蛋白质晶体结构仍然不足。没有这些结构信息，将无法更好地明确降解酶的降解机制和反应机理。通过X 射线衍射或计算机辅助的分子动态模拟，可以帮助解析降解酶在复合底物或产物前后结构的变化，进而更好地指导学者进行酶分子的理性改造。同时，从“表观降解”到“内在脱毒”，真菌毒素降解酶还需要不断地进行安全性评价。2014 年5 月，欧盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）首次评估并发布了商业伏马菌素酯酶（FUMzyme®，Biomin GmbH）作为猪技术饲料添加剂的安全性和有效性。FUMzyme 是一种饲料添加剂，旨在降解用于家禽育肥饲料中的FB。结果表明，在剂量范围（40～300 U/kg，以饲料质量计）内使用，FUMzyme 对猪是安全的且具备降解饲料内目标真菌毒素的能力。此外，添加了FUMzyme 的饲料并没有检测得出致突变性或遗传毒性的结论，表明在猪饲料中使用添加剂FUMzyme对猪肉产品的消费者来说是安全的。2022 年1 月，EFSA 对Biomin GmbH 的另一款玉米赤霉烯酮水解酶（ZenA）的使用安全性进行了评估。ZenA 是由含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌DSM32731 生产。结果表明，在饲料中添加ZenA 对所有陆生动物物种都是安全的，具体添加量如下（以饲料质量计）：鸡100 U/kg，猪200 U/kg，奶牛250 U/kg，小牛犊400 U/kg，狗450 U/kg。然而，受限于毒性数据，大多数真菌毒素降解酶的使用安全性仍然存疑。例如，尽管来自杏鲍菇（PS419，Ery4）的漆酶能够100%降解0.05 μg/mL 的AFB1，但是没有关于Ery4 更多的毒理学数据，Ery4 无法被进一步开发和应用于降解AFB1。因此，更多的研究需要集中在真菌毒素降解酶的鉴定、降解酶的分子改造以及降解产物的毒性评价等方面。相信在不久的将来，真菌毒素降解酶有望出现在饲料和食品行业中。
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