段丽颖，任欠欠，杜义龙，李艳荣，赵胜男，潘海峰
（承德医学院，河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000）
山楂叶为蔷薇科山楂属植物山里红Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br 或山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥叶，具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂的功效，收录于2020 年版《中国药典》［1］中，常用于治疗冠心病、心绞痛等心脑血管疾病［2］。现代研究表明，山楂叶富含黄酮类、萜类、有机酸等化合物［3］，其中总黄酮是其发挥抗动脉粥样硬化、降压降脂、增加冠脉血流量等作用的主要活性成分［4-5］，并且在改善糖脂代谢紊乱、降低血糖血脂方面也发挥着重要作用［6-7］，但对其降低血糖方面的研究尚不完善。
中药所含化学成分较为复杂，指纹图谱可反映其整体性［8］，同时借助聚类热图能以更直观的方式展现数据疏密、样品地区差异的变化，并且通过化学计量学方法可进行全面质量评价［9］。因此，本实验以体外抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性试验考察山楂叶降糖作用，同时建立不同产地样品UPLC 指纹图谱，并采用双变量相关分析、热图、聚类分析、主成分分析对该药材进行质量评价，以期为其产地区分及质量研究提供参考依据。
1.1 仪器 Waters Acquity 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；
Multiskan FC 酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；
JA5003 上皿天平（千分之一，天津天马衡基仪器有限公司）；
AG245电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；
DHG-9070A 电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
HH-2 数显恒温水浴锅（常州荣华仪器制造有限公司）；
WIGGENS TM-1 涡旋振荡器（北京桑翌实验仪器研究所）；
HC-2062 高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；
KQ-700 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
TCP-010-096洁特细胞培养板（广州洁特生物过滤股份有限公司）；
实验室PH 计［瑞士梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；
FW100 高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；
MH-2 微型振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2 试剂与药物 α-淀粉酶（猪胰腺）（批号RM19Y304）、α-葡萄糖苷酶（批号RM20Y1225）、对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG，批号RM20Y807）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；
阿卡波糖（批号113HO31，北京索莱宝科技有限公司）；
淀粉（批号RM1248-50KU，天津市光复精细化工研究所）。
绿原酸（批号18071907）、牡荆素葡萄糖苷（批号 20042305）、牡荆素鼠李糖苷（批号18060103）、牡荆素（批号16070601）、芦丁（批号18122901）、金丝桃苷（批号19103001）、异槲皮素（批号18062702）对照品均购自成都普菲得生物技术有限公司。甲醇、乙腈、四氢呋喃为色谱纯，均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；
甲酸为分析纯；
水为纯净水（批号JYSPYL2027，杭州娃哈哈集团有限公司）。
山楂叶共15 批，于2020 年11 月采自全国各地，经全国老中医药专家（传统鉴定）学术经验继承人孙宝惠主任药师鉴定为蔷薇科山楂属植物山里红Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br的干燥叶，均符合2020 年版《中国药典》 一部项下要求，具体见表1。
表1 样品信息Tab.1 Information of samples
2.1 UPLC 指纹图谱建立
2.1.1 溶液制备
2.1.1.1 供试品溶液 山楂叶经粉碎机粉碎后过80 目筛，取约1.0 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，加入50 mL 60%甲醇，称定质量，密封，超声处理30 min 后静置15 min，60%甲醇补足减失的质量，12 000 r／min 离心10 min，取上层清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得（质量浓度约为20 mg／mL）。
2.1.1.2 对照品溶液 精密称取绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异槲皮素对照品适量，50%甲醇溶解，制成质量浓度分别为38.13、10.28、14.02、5.73、8.52、5.95、8.52 μg／mL 的溶液，即得。
2.1.2 色谱条件 ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；
流动相水（含0.1%甲酸）（A）-（乙腈-四氢呋喃-甲酸）（120∶10∶0.1）（B），梯度洗脱（0～6 min，92%～89%A；
6～10 min，89%～83% A；
10～15 min，83%～83.5%A；
15～18 min，83.5%～80%A；
18～20 min，80%～66%A；
20～22 min，66%～0A；
22～24 min，0A）；
体积流量0.2 mL／min；
柱温30 ℃；
检测波长340 nm；
进样量2 μL；
样品室温度25 ℃。
2.1.3 方法学考察
2.1.3.1 精密度试验 取同一份供试品溶液（S2），在“2.1.2” 项色谱条件下进样测定6 次，测得各共有峰相对峰面积RSD 均小于3%，相对保留时间RSD 均小于1%，表明仪器精密度良好。
2.1.3.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液（S2），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.2” 项色谱条件下进样测定，测得各共有峰相对峰面积RSD 均小于3%，相对保留时间RSD 均小于1%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。
2.1.3.3 重复性试验 取同一批药材（S2），按“2.1.1.1” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.2” 项色谱条件下进样测定，测得各共有峰相对峰面积RSD 均小于3%，相对保留时间RSD均小于1%，表明该方法重复性良好。
2.1.4 图谱生成 取对照品、供试品溶液适量，在“2.1.2” 项色谱条件下进样测定，以S1 图谱为参照，设置时间窗宽度为0.2 min，多点校正后采用中位数法生成指纹图谱（图1），以稳定性较好的23 个色谱峰为共有峰。再采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A 版）对15 批样品进行相似度评价，结果见表2。然后，通过对照品色谱图（图2）对共有峰进行指认，确定5、16、18、19、21、22、23 号色谱峰分别为绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异槲皮素。
图1 15 批样品UPLC 指纹图谱Fig.1 UPLC fingerprints for fifteen batches of samples
表2 15 批样品相似度Tab.2 Similarities of fifteen batches of samples
图2 对照品UPLC 色谱图Fig.2 UPLC chromatogram of reference substances
2.2 降糖活性研究 参考文献［10］报道，并对实验条件稍加调整。
2.2.1 溶液制备
2.2.1.1 样品溶液 取“2.1.1.1” 项下供试品溶液续滤液1 mL 至蒸发皿中，水浴蒸干后以等体积PBS 缓冲液（pH 6.8）复溶，即得（质量浓度约为20 mg／mL）。
2.2.1.2 阿卡波糖溶液 称取阿卡波糖（阳性药）适量，PBS 缓冲液溶解，得1 mg／mL 母液，PBS 缓冲液稀释成系列质量浓度，即得。
2.2.2 α-淀粉酶活性抑制实验 取20 μL 不同质量浓度样品溶液至1 mL 离心管中，再加入20 μL 0.35 U／mL α-淀粉酶溶液，涡旋5 s 并瞬时离心后在37 ℃下孵育15 min，加入20 μL 0.15%淀粉溶液，涡旋离心，在37 ℃下孵育15 min，加入80 μL DNS 溶液终止反应，煮沸5 min 后冰水浴冷却至室温，将离心管内的溶液转移至96 孔板中，酶标仪上于540 nm 波长处检测吸光度值，每个质量浓度平行3 份，作为样品组；
以等体积PBS 缓冲液代替α-淀粉酶溶液，其他操作同上，作为样品对照组；
以等体积PBS 缓冲液代替样品溶液，其他操作同上，作为对照组；
以等体积PBS 缓冲液代替样品、α-淀粉酶溶液，其他操作同上，作为空白组；
以等体积不同质量浓度阿卡波糖溶液代替样品溶液，其他操作同上，作为阳性对照组，计算抑制率，公式为抑制率（%）＝｛［（对照组吸光度－空白组吸光度）－（样品组吸光度－ 样品对照组吸光度）］／（对照组吸光度－ 空白组吸光度）｝ × 100%，再将数据导入SPSS 21.0 软件计算IC50值，结果见表3。
表3 α-淀粉酶双变量相关分析、色谱峰筛选、IC50值、主成分评分Tab.3 Bivariate correlation analysis，chromatographic peak screening，IC50 values and principal component scores for αpancreatic amylase
2.2.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制试验 在96 孔板中加入60 μL PBS 溶液，再加入20 μL 不同质量浓度样品溶液、20 μL 0.5 U／mL α-葡萄糖苷酶，振荡混匀，37 ℃孵育15 min；
加入20 μL 2.5 mmol／L PNPG 继续孵育15 min，加入80 μL 0.2 mol／L 碳酸钠终止反应，酶标仪上于405 nm 波长处测定吸光度值，每个质量浓度平行3 份，作为样品组；
以等体积PBS 缓冲液代替α-葡萄糖苷酶溶液，作为样品对照组；
以等体积PBS 缓冲液代替样品、α-葡萄糖苷酶溶液，作为空白组；
其余同“2.2.2”项分组，按“2.2.2” 项下公式计算抑制率及IC50值，结果见表4。
表4 α-葡萄糖苷酶双变量相关分析、色谱峰筛选、IC50值、主成分评分Tab.4 Bivariate correlation analysis，chromatographic peak screening，IC50 values and principal component scores for α-glucosidase
2.2.4 结果分析 由表3～4 可知，样品对α-淀粉酶有一定抑制作用，但弱于阿卡波糖，而在抑制α-葡萄糖苷酶活性方面与阿卡波糖相当，甚至更优；
对2 种酶活性的抑制效果与产地呈现一定相关性，其中河北、辽宁产样品优于山东、山西产样品。
2.3 统计分析
2.3.1 双变量相关分析 以23 个共有峰峰面积及α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的IC50值为原始数据，导入SPSS 21.0 软件中进行双变量相关分析，分别筛选出与抑制α-淀粉酶活性显著相关（P＜0.05），并符合KMO 检验（KMO＞0.5）、Bartlett 球形检验（P＜0.05）的13 个色谱峰，作为α-淀粉酶组；
与抑制α-葡萄糖苷酶活性显著相关，并符合相关检验标准的14 个色谱峰，作为α-葡萄糖苷酶组，结果见表3～4。
2.3.2 热图绘制 将色谱峰峰面积导入MetaboAnalyst 5.0 平台（https：／ ／www.metaboanalyst.ca／），选择“Statistical Analysis” 模块，对数据进行筛选、归一化等操作，输出热图，结果见图3。由此可知，2 个热图结果具有相似性，并呈现一定聚类特征，整体上可分为3 类，河北、辽宁产样品在成分含量上相似性较高，可聚为一类；
山西、山东产样品与河北、辽宁产样品在成分含量上具有较大差异，分别聚为一类。
图3 样品热图Fig.3 Heat maps of samples
2.3.3 主成分分析 采用SPSS 21.0 软件对色谱峰进行KMO 检验、Bartlett 球形检验，其中α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶KMO 度量值分别为0.789、0.642，Bartlett 球形检验P值均小于0.001，提示各变量间存在显著相关性，可进行主成分分析。按照对应特征值＞1 的原则提取主成分，α-淀粉酶提取1 个主成分，累积方差贡献率达85.886%；
α-葡萄糖苷酶提取2 个主成分，第一主成分特征值为10.549，贡献率为75.353%，而第二主成分特征值为1.657，贡献率为11.834%，累积方差贡献率达87.187%。结合初始因子载荷矩阵（表5）及公式Fi＝A×ZX（A为特征向量矩阵，ZX 为标准化数据矩阵）计算主成分得分，再结合各成分贡献率建立评分模型，分别为Fα-淀粉酶组＝0.859 ×F1、Fα-葡萄糖苷酶组＝0.753×F1＋0.118×F2，并进行排序，结果见表3～4。由此可知，2 种酶主成分评分排序一致，均以河北、辽宁产样品较高，排名靠前；
山东、山西产样品较低，排名靠后。
表5 初始因子载荷矩阵Tab.5 Loading matrices for initial factors
本实验对流动相组成进行考察，主要关注有机相乙腈，因其分离度不好，故加入不同比例的四氢呋喃以使分离度得到改善，同时峰形不理想，故又加入一定比例的甲酸得以改善。最终确定，最优流动相为水（含0.1%甲酸）-［乙腈-四氢呋喃-甲酸（120∶10∶0.1）］，此时各成分分离效果最好，并且可改善前期由于流动相混合不充分导致的色谱峰前延问题。
由表3～4 可知，山楂叶对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用显著优于α-淀粉酶，峰1、2、4、5（绿原酸）、7、9、11、18（牡荆素鼠李糖苷）、21（芦丁）与抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性均具有显著相关性，并且α-葡萄糖苷酶相关性系数普遍高于α-淀粉酶。另外，5 号峰（绿原酸）、16 号峰（牡荆素葡萄糖苷）、18 号峰（牡荆素鼠李糖苷）、19 号峰（牡荆素）、21 号峰（芦丁）、22 号峰（金丝桃苷）、23 号峰（异槲皮素）与抑制α-葡萄糖苷酶活性均显著相关，并且大多存在单糖、寡糖结构，具有α-葡萄糖苷酶抑制剂化学结构特征［11-12］，可能是山楂叶抑制α-葡萄糖苷酶活性优于α-淀粉酶的原因。
河北、辽宁产山楂叶对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果略高于山东、山西产，其原因可能与经纬度有关。本实验中15 批样品采收于河北承德、辽宁葫芦岛、山东临沂、山西运城，其中河北承德样品采自北纬40°29′57″、东经117°26′38″；
辽宁葫芦岛样品与其接近，为北纬40°37′10″、东经119°40′22″；
山东临沂、山西运城样品经纬度相近，分别为北纬35°27′2″、东经117°59′10″及北纬35°20′58″、东经111°10′38″。体外降糖实验结果显示，山楂叶分组趋势与纬度信息有较高的相关性，并且其产地的海拔、日照时间、气温、降水量等因素可能会影响黄酮含量，进而影响体外降糖试验结果。
本实验根据山楂叶对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其UPLC 指纹图谱的共有峰数据进行双变量相关分析，采用主成分分析进行综合评分，发现所得结果与体外降糖实验结果相互印证，表明该方法科学可靠，可用于山楂叶产地区分、体外降糖效果评价，也能为今后全面评价该药材质量提供数据支持及方法参考。
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