刘子杨 李雅欣 刘加强
感染、创伤、肿瘤或发育异常等原因造成的颌骨缺损患者数量与日俱增，颌骨缺损往往会很大程度上影响患者的生理以及心理健康，因此颌骨缺损的修复已经成为口腔临床面临的重大难题［1］。传统治疗颌面部骨缺损的方法有自体骨移植和异体/异种骨移植，但自体骨移植供体骨量有限且术后并发症可能导致移植失败，而异体/异种骨组织虽然来源较广泛，但易引起排异反应和感染［2］。这就需要我们探索开发具备良好的生物相容性、骨形成和骨诱导性能的人工骨修复材料。目前临床上常用的人工组织工程骨修复材料主要分为金属材料、非金属材料及高分子聚合物材料三大类，一些骨修复材料如钛及钛合金，由于拥有良好的生物相容性、力学性能等优点已被广泛应用于颌骨缺损的修复，但是现有修复材料普遍存在成骨活性仍不够理想的问题，鉴于此，很多研究致力于对原有骨修复材料进行改性，希望使材料拥有更好的促进骨再生的性能［3］。
骨再生是一个复杂的过程，促进骨生成细胞层面主要表现为促进细胞黏附、增殖以及成骨分化，调节成骨与破骨的平衡，提高细胞间矿化水平，生物体层面则表现为材料能修复骨缺损并促进了骨小梁的生长和新骨形成。骨髓间充质干细胞是多能干细胞，可以向成骨细胞分化，这是骨形成过程中的重要环节［4］。良好的骨修复材料可通过调控成骨相关信号通路促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化，促进骨形成和骨整合，进而提高临床骨修复的成功率。以往许多研究发现，不同的离子在细胞环境及骨骼愈合过程中起到一定作用［5,6］，特别是某些金属元素，作为生物活性成分在材料改性方面做出的贡献逐渐受到重视［7-10］。本文将针对近年来常用于增强材料成骨活性的金属元素的研究进展做一综述，重点对其在骨生成中作用及相关细胞学机制进行总结与讨论。
镁离子是参与人体正常生命活动和代谢过程的重要常量元素，是构成骨骼的主要元素之一，有研究表明镁离子可以通过诱导细胞的成骨分化促进骨生成［11,12］，同时镁合金也因为具有良好的生物相容性和机械性能在骨缺损方面受到了广泛研究［13］。下面就这一方面主要被研究的四条信号通路做一总结。
1.1 Wnt/β-catenin 信号通路 已有很多研究肯定了Wnt/β-catenin 信号传导通路在骨形成过程中的重要调控作用。Wnt/β-catenin 调控在骨形成过程中的经典途径是Wnt1 组（包括Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8 和WntSb）与Lrp/Fzd相互结合，通过一系列胞质蛋白的相互作用，使β-catenin 在胞质内累积，进而入细胞核内与转录因子TCF/LEF-1 相互作用，并通过与相应的DNA 序列结合来调节其下游成骨相关基因的转录［14］。Hung CC 等［8］研究发现，镁离子刺激能使β-catenin 表达增加，调控下游基因的转录促进细胞成骨分化。Wang Y 等［15］得出了类似的结论，他们发现镁离子诱导糖原合成酶激酶3β 磷酸化，阻碍了糖原合成酶激酶3β 与β-catenin 的结合，导致细胞质内β-catenin水平升高。
Tsao YF 等［16］则研究了细胞外高浓度镁对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，以及镁转运蛋白SLC41A1 在成骨分化过程中的作用。与之前的结论相反，他们认为细胞外高浓度镁会抑制矿化过程，SLC41A1 在这个过程中发挥重要作用，Wnt 信号被认为参与SLC41A1 介导的调节，敲除SLC41A1 可以促进成骨过程中的矿化。对于上述相反的结论，可能与研究中不同的镁离子的浓度、细胞来源、培养类型以及成骨分化阶段等因素有关。
1.2 MAPK/ERK 信号通路 丝裂原活化蛋白激 酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）是真核生物细胞内广泛存在重要信号传导系统，镁促骨再生的MAPK 信号通路机制也被广泛研究。MAPK 信号转导是以三级激酶级联的方式进行的，首先MAPKKK 受有丝分裂原刺激磷酸化而激活，在此基础上MAPKKK 转而磷酸化激活MAPKK，最后由MAPKK 磷酸化MAPK 使其活化，磷酸化的MAPK 转入核内调节下游基因的表达。传统的MAPK 包括3个亚家族成员：ERK1/2、JNK1/2/3、p38，为了明确具体哪些信号分子参与成骨相关信号的介导，Kim JA 等［17］制备了一种新型陶瓷支架，他们发现该材料可诱导原代人骨髓间充质干细胞和小鼠成骨细胞系MC3T3-E1 细胞矿物质沉积和成骨细胞标志基因（Runx2、Col1a1、Oc、Bsp）表达，骨形态发生蛋白质7（BMP7）表达量显著提高，接着他们分析了各种信号分子的磷酸化水平，与对照组相比，实验组MEK1/2 和ERK1/2的磷酸化水平增高，而p38和JNK 的磷酸化水平没有改变，这些结果表明该材料通过磷酸化MEK1/2和ERK1/2诱导BMP7的表达。
Zhao M 等［18］以一种新型纳米石墨烯-磷酸钙-壳聚糖/AZ91D 复合材料为研究对象，检测了这种材料在长期浸泡过程中的pH 值和离子释放，他们发现该材料可长期维持细胞内ERK 信号通路的上调，实验组ERK 的磷酸化水平表达均显著高于对照组。Wang Y 等［15］得出类似的结论，他们通过腐蚀试验确定纯镁的降解能够产生碱性微环境，且发现用镁离子处理后ERK 的磷酸化增加，由此推断镁离子的成骨作用可能与微环境的pH 变化和MAPK/ERK 信号通路的激活有关。以上实验都强调了，除了镁离子本身具有的生物活性外，它所形成的pH环境也会对细胞行为也会产生影响。
Yan YR 等［19］开发了一种二氧化钛纳米管阵列并将镁结合到纳米管中，以增强钛植入物的成骨活性，结果显示细胞中成骨相关基因的mRNA 表达在这种材料表面均显著上调，ERK1/2 信号激活。他们认为该材料促进成骨的原因有两方面，纳米形貌和释放的镁离子：材料本身的纳米结构表面可以模拟天然骨细胞外基质，以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化；
而其中的镁营养元素对骨形成和血管生成起重要作用，细胞中成骨相关基因（Col、Ocn、Runx2）和血管生成相关基因（Vegf、Hif-2）表达均发生上调。镁离子一方面通过促进成骨细胞的增殖分化直接促进成骨，另一方面镁是损伤组织周围血管生成的基本元素，加速的血管生成可以促进营养物向植入物周围的运输，从而加速新骨形成和骨愈合［20-23］。
1.3 PI3K/Akt 信号通路 磷酸肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol 3-Kinase,PI3K）是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的信号可使其激活，进而招募Akt从细胞质转移到细胞膜上并使其磷酸化，磷酸化的Akt转至细胞核内激活转录因子启动转录［24］。近年来开始有研究还珠PI3K蛋白家族与细胞成骨分化的关系。Zhang XZ等［25］研究发现镁离子通过TRPM7通道进入细胞中，接着通过PI3K/Akt信号通路上调转录因子Runx2和碱性磷酸酶（ALP）的表达，从而显著增强人成骨细胞的成骨活性；
另一方面TRPM7/PI3K信号通过诱导细胞迁移,将成骨细胞从低镁环境招募到高镁环境中，增强相关信号通路的激活。
1.4 BMP/Smad 信号通路 骨形态发生蛋白质（bone morphogenetic protein，BMP）可通过与膜中的丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，并随后磷酸化下游效应物，磷酸化的Smad1/5 然后被转移到细胞核中以激活靶基因转录，已有研究肯定了BMP/Smad 信号通 路在促 成骨方 面的作 用［26］。Zhang XF等［27］系统地研究了巨噬细胞和骨髓间充质干细胞参与的镁离子的骨免疫调节特性。他们认为微量镁离子（100 mg/L）具有促进骨形成的骨免疫调节特性。更具体地说，微量镁离子诱导巨噬细胞的M2 表型变化和抗炎细胞因子的释放，而镁离子/巨噬细胞条件培养基促进骨髓间充质干细胞成骨，很可能是通过BMP/Smad信号通路实现的。
通过上述研究我们可以了解到，镁离子对成骨的促进作用主要体现在以下几个方面；
首先是对成骨相关细胞的直接影响，成骨相关细胞包括间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞等，这其中关于镁离子促进间充质干细胞的增殖与成骨分化的相关研究较多，对于成骨细胞、破骨细胞存在怎样的作用还需要进一步深入研究；
其次是镁离子通过调节成骨免疫微环境间接的促进成骨，例如通过影响巨噬细胞极化、蛋白吸附等；
最后需要注意的是，镁离子促进血管生成的作用也不容忽视，而血管的生成对骨的生长修复至关重要。镁促进骨再生这一领域已经有很多研究，因此在这里做个总结，下面介绍的金属元素对于促进骨再生的作用机制的研究侧重点大多也符合上述几个方面，有特殊的会再指出。
许多研究表明，多孔钽作为一种理想的新型移植材料，表现出优异的细胞相容性和诱导骨形成的能力［28-30］。
Shi LY 等［31］试图通过添加钽涂层来提高材料的性能，实验结果证实钽比钛更能促进细胞的黏附和增殖，且钽表面的骨髓间充质干细胞具有更好的成骨分化趋势。在进一步研究中，他们发现Wnt/β-catenin 和TGF-β/Smad 信号通路参与这个过程的调节。钽组β-catenin 水平显著较高，且下游成骨相关基因（Runx2、Col1a1、Axin2、Smad6、C-myc 等）较钛组高表达。另外体外实验结果也证实了TGF-β/Smad 信号通路的激活，使用Smad3 特异性抑制剂阻断可显著抑制骨分化。研究者还进行了体内实验，将常规钛椎弓根螺钉和钽涂层螺钉植入猪的双侧椎弓根，结果表明，钽促进细胞黏附和增殖的能力更强，显著提高骨髓间充质干细胞的矿化水平，且钽涂层螺钉对破骨细胞有抑制作用。显微CT、组织学和生物力学检查也显示，与钛涂层螺钉相比，钽涂层螺钉显著促进了骨小梁的生长。这项研究的意义主要体现在以下三个方面：(1）在钛合金上制备钽涂层实现了将钛的机械性能与钽的生物学活性的结合。(2）发现了钽对于破骨细胞的抑制作用，正如上文提到的，很多研究侧重于材料对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，而对于成骨细胞与破骨细胞的研究相对较少。(3）体内实验证明了材料的生物安全性以及应用于临床的可能性。
MAPK/ERK 信号的激活在钽促进成骨的相关研究中也常被涉及Dou XJ 等［32］制备了相同孔径的多孔六铝四钒钛和多孔钽来培养大鼠的间充质干细胞，随后测定两组的成骨相关基因的mRNA 表达水平以及蛋白表达水平，结果表明多孔钽激活MAPK/ERK 信号通路，上调了Ⅰ型胶原、骨结合素和骨钙素等成骨基因的表达，两组用MAPK/ERK 特异性抑制剂U0126 处理后结果无统计学差异。Lu MM 等［33］研究思路类似，但他们为了最小化结构因素的影响，将钽和钛基底抛光至镜面光洁度，评估两种材料对整合素α5β1/ERK1/2 级联介导的小鼠骨髓间充质干细胞成骨的效应。他们通过碱性磷酸酶活性、茜素红染色、反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法，评价两种基质对细胞成骨的影响，此外通过RNA 干扰上调和下调整合素α5 和β1，以及通过用U0126 抑制ERK1/2 来评估整合素α5β1/ERK1/2通路在钽和钛的成骨诱导性能中的作用。结果表明种植在钽表面的细胞成骨活性更好，而整合素a5 或整合素b1 的下调或ERK1/2的抑制会损害钽表面的成骨细胞分化。
以上所述的研究中，研究者以较常用的钛合金作为对照，以人/大鼠/小鼠的骨髓间充质干细胞或成骨细胞系为研究对象，评估了钽对干细胞的成骨分化诱导能力。实验通过测定成骨标志物、成骨相关基因的mRNA 表达水平以及蛋白表达水平，证明了Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad、MAPK/ERK、整合素信号通路等在促进细胞成骨分化方面的作用。但需要注意的是，虽然钽在骨缺损修复中表现出优越的生物学活性，但钽的弹性模量远高于人体骨组织，容易产生应力屏蔽效应，不适合作为承重医疗植入物长期使用，因此将钛合金的机械性能与钽的生物学活性相结合可能是未来一个有意义的课题［23］。
锶是人体内的微量元素，在植入物表面添加锶或制备含锶的涂层可显著提高植入物的生物活性［34,35］。Chen XY 等［36］采用水热法制备了SrCl2溶液中喷砂处理的大颗粒双面酸蚀钛（SLA），体外检测小鼠成骨细胞系MC3T3-E1 细胞在该表面的增殖、黏附和分化情况，发现SLA-Sr 组明显优于SLA 组。对24 只新西兰大白兔进行体内实验，结果显示SLA-Sr 组在3 周和6 周后与SLA 组相比，种植体骨-种植体直接接触量和种植体周围骨体积显著增加，说明SLA-Sr 种植体在骨结合早期的生物学效应明显优于SLA 种植体,体内实验的结果同时证明了材料具有良好的生物相容性，两组种植体在组织学上均与周围骨直接接触，显微镜下未见骨-种植体界面有炎症表现。
关于深 入机制 的研究，Li M 等［37］评估了Mg-1Ca-Xwt% Sr（(X=0.2，0.5，1.0，2.0）合金对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1 细胞成骨分化和矿化的影响，结果显示Mg-1Ca-2.0Sr 合金显著上调成骨相关基因的表达，且能快速诱导细胞外信号MAPK/ERK 激活。同时他们还关注到，增加锶的加入量可以细化晶体颗粒，这是提高合金力学性能和腐蚀性能的主要因素；
此外随着锶含量的增加，合金对蛋白质的吸附能力也增强，而蛋白质在表面的吸附对早期细胞附着和扩散的反应有至关重要的影响。Wang Z 等［38］通过化学沉积法在可生物降解的镁-钕-锌-锆合金（JDBM）表面开发了一种SrHPO4涂层，其目的是为了提高材料抗腐蚀性和机械强度的同时，提高其促成骨性能。用该材料离子释放试验提取物培养小鼠成骨细胞系MC3T3-E1 细胞，研究结果显示实验组Toll 样受体4增加，下游PI3K/Akt信号通路激活，引起细胞的增殖和生长。同时近年来也有许多体内研究证实，许多掺杂锶的生物活性材料，如锶掺杂的磷酸钙生物活性陶瓷、生物活性玻璃、复合凝胶等，均具备加速周围宿主骨形成的能力，对实验动物的骨缺损有很好的修复效果［39,40］。
上述研究都证明了锶离子促进成骨的生物学活性，随着材料降解锶离子缓慢释放，在局部形成富含锶离子的微环境，这是掺锶材料促进骨形成的主要原因。但是与此同时我们也可以得出另一个结论，在材料内部或表面添加金属活性离子或涂层，也可以使材料的形貌结构、机械性能、抗腐蚀性能等发生改变，而这些性能的提高与改善将有利于其更好的骨重建。
锌生物材料因其与骨相似的力学性能、生物相容性和与组织愈合速度更匹配的降解性，近年来成为承载医用植入物的研究热点，与目前报道的铁基和镁基可生物降解合金相比，锌基合金不存在组织愈合腐蚀速率不匹配和缺乏延展性的限制［41,42］。此外，研究发现锌可以通过促进多种途径增强细胞成骨能力，因此锌离子成为许多生物骨支架的添加因子之一［43,44］。有研究表明，锌离子进入细胞后激活cAMP-PKA 途径，并触发细胞内Ca2+反应，导致MAPK 的激活，此外锌离子还激活了Gαq-PLC-AKT 通路，最终所有这些信号将导致细胞生长和分化、细胞外基质矿化、成骨和其他细胞活动的差异调节增强［45］。此外，锌离子可以促进植入物周围血管的生成，这同样有利于骨结合与新骨生成［42,46］。
锆是一种常用的用于牙科和骨科植入物的元素，有研究将原代人成骨细胞培养在不同浓度的硝酸锆的培养基中，观察成骨细胞的增殖、分化和钙沉积情况，结果发现在锆离子作用下，BMP2 和BMP 受体的基因表达增加，细胞质和细胞核中磷酸化的Smad1/5 水平显著增加，进而下游转录因子被激活，促进了细胞的成骨分化［47］。值得一提的是，目前临床上最常用的含锆元素的材料为氧化锆材料，氧化锆虽然因其良好的生物相容性、机械强度以及美观效果，作为基台及种植体材料被广泛应用于口腔领域［47,48］，但氧化锆属于一种生物惰性陶瓷，吸引蛋白质及成骨细胞的黏附的能力较差，不利于种植体的骨整合［49］，这也启示我们，如何采用物理或化学方法使氧化锆材料改性，或者采用何种方式在保证氧化锆机械力学性能的同时发挥锆离子的生物学活性，可能是是未来研究的一个方向。
随着纳米技术的发展，纳米银粒子（AgNps）逐渐成为骨组织工程研究关注的热点，它的抗菌能力在以往研究中受到肯定，同时有研究指出它还具备一定的促成骨能力［50］。Cao HL 等［51］采用等离子体浸没离子注入法制备了AgNps 并将其固定在钛表面，他们研究发现AgNps 通过引发电偶极析氢反应对整合素α5 具有重要的激活作用，从而激活整合素α5 介导的MAPK/ERK 信号级联，促进大鼠骨髓干细胞成骨分化。Zhang RZ 等［52］同样证明了AgNps 的促成骨作用，他们发现AgNps 在4 M 浓度时能够促进骨髓间充质干细胞的增值，在10 M 浓度时明显促进成骨分化，但同时他们也指出AgNps 浓度可能对实验结果造成重要影响，低浓度可能不足以促进体外培养的间充质干细胞向成骨细胞分化，高浓度则会使骨髓干细胞的活性受到抑制。事实上AgNps对细胞存在潜在毒性已被很多研究证实，实际应用中我们应该更谨慎的考虑纳米粒子的颗粒直径、浓度等因素，评估其生物安全性。
除上述提到的一些金属元素外，还有一些金属元素被证实可以起到促成骨的作用，例如锂［53-55］、铜［10,56］、钴［57］、钆［58］、镓［9］等。锂离子可激活Wnt/β-catenin 通路，促进前体细胞向成骨方向转化，同时抑制破骨细胞活性和骨吸收［54］。除此之外锂离子能够刺激骨髓间充质干细胞分泌含miRNA-130a 的外泌体，激活血管内皮细胞中的PTEN/AKT 信号转导通路，促使血管内皮细胞增殖、迁移和管状形成的增加，加速血管生成从而促进成骨［55］。而其余离子或因为细胞或毒性比较明显应用受限，或研究还不够深入安全性存疑，因此研究相对较少，在生物材料中的应用也存在争议，在此不进行过多阐述。
修复颌骨缺损始终是临床上的一个重要难题，关于骨修复材料的创新和改良也是日新月异。本文主要总结了一些生物活性骨组织工程材料的研究进展，利用金属元素对细胞、生物体的作用提高材料的促成骨性能。本文详述了三种金属：镁、钽、锶，简述了三种金属：锌、锆、银，并提及了其他一些也具有成骨诱导性能的金属离子。通过对这些研究的总结归纳与分析，我们总结出一些共性规律。
首先，这些材料发挥促进成骨作用往往体现在以下几个方面：(1）构建含有某种金属元素的材料，其中的金属离子可以释放到细胞生存的环境中，在材料表面与骨组织之间形成一个局部低浓度的离子环境，活性离子可以激活多种细胞内信号通路，进而调节细胞行为和骨重建的进程；
(2）金属离子的加入可以使材料的理化性能发生改变，例如能细化晶体颗粒，提高合金力学性能和腐蚀性能；
或增加材料的蛋白质的吸附能力，有利于早期细胞附着和扩散。其次，随着研究的深入，内在成骨相关的信号通路也逐渐被研究。骨髓间充质干细胞是一种多能成体干细胞，在成骨的相关研究中广泛受到关注，可在体外条件下诱导分化为成骨细胞，上文所提到的金属离子发挥促成骨作用，也大多是通过诱导间充质干细胞成骨分化实现的。参与成骨的比较重要的信号通路有Wnt/β-catenin 通路、MAPK 通路、整合素通路、磷脂酰肌醇3-激酶通路、BMP/Smad 通路等，这些信号通路调节着细胞的增殖、分化、细胞外基质矿化、成骨和其他细胞活动，最终维持了骨代谢平衡。同时需要注意的是，金属离子发挥作用并不是依靠单一信号通路，而是多条通路相互作用相互影响，共同调节细胞的生物学活动，这还需要进一步深入研究，探讨更为复杂的分子机制。
还有一点值得关注，生物相容性及生物毒性是决定临床应用的关键因素，是生物材料开发绕不开的问题，而这牵涉的内容又是多方面的。生物材料中金属离子发挥的作用是复杂而精妙的，成骨作用的发挥会受到移植部位与范围、材料降解速率、离子释放浓度等的影响，局部离子浓度过低可能无法起到很好的处成骨作用，而浓度过高则会有细胞毒性，这需要更多的体内外实验进一步深入研究，目前相关的体内实验及专门的研究还相对不足。
这篇综述的创新性在于总结了近年来含不同金属元素的骨修复材料促进成骨的作用及可能分子机制，希望为更多科研工作者提供实验设计灵感与思路；
局限性在于文中总结的一些研究只涉及体外细胞实验，侧重于研究金属离子对骨代谢相关细胞产生的作用，而真正应用还需要考虑到材料的机械性能、抗腐蚀性能、生物毒性、生物相容性等很多问题，这尚需要进行更多的体内实验和临床试验来评测。