刘姝岑， 朱雪红， 宾力， 尹莉， 黄少凤， 陆丽妙， 刘慧星， 林忠，3
(1. 广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530000；
2. 广西壮族自治区生殖医院妇产科，广西 南宁 530000；
3. 柳州市妇幼保健院妇产科，广西 柳州 545000)
子宫内膜损伤是指因各种宫腔操作不当或次数过多所引起的子宫内膜基底层损伤，导致患者术后出现宫腔粘连、内膜薄化，并引发一系列包括经量过少、闭经、习惯性流产以及受孕困难等临床症状[1-2]。根据相关流行病学显示[3]，自2000年以来，计划生育人工流产术后造成子宫内膜损伤，从而导致继发性不孕患者数逐年增加。目前，临床上针对子宫内膜损伤后修复的方法很多，但对于中重度损伤后内膜再生的方法却十分有限。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是目前再生医学领域中应用较为广泛的细胞类型之一[4]，其具备独特的生物学特性，可分化为不同的细胞系，并分泌高水平蛋白，在免疫调节、伤口愈合、组织再生以及血管生成等方面发挥着重要作用[5]。除此之外，MSCs还可释放外泌体，以及联合组织工程发挥其促进子宫内膜损伤修复的治疗作用。因此，本文对近些年来国内外有关MSCs在子宫内膜损伤后修复的相关机制进行总结并作一综述。
1.1 子宫内膜生理性修复
女性子宫内膜具有高度再生修复能力，按照其功能、结构可分为内部基底层和外部功能层，其中基底层主要由基质构成，功能层则由结缔组织、腺体组织构成。月经期间，子宫内膜原有上皮细胞脱落，腺体结构发生重塑，周围基质中子宫内膜干细胞分化成新的上皮细胞，从而替代前者。该过程为非激素依赖性，且不存在细胞增殖。而在后续的间质细胞及血管修复过程中，随着体内雌、孕激素的变化，上皮、间质细胞增殖分化，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)被成纤维细胞所重塑，进而子宫内膜血管重建，最终完成无瘢痕修复[6]。虽然基底层在月经期间几乎不脱落，且不受卵巢激素影响，但其完整性对于子宫内膜修复具有重要意义。生理状况下，内膜在增殖期逐渐增厚至7～14 mm，随后转化为分泌期，从而为胚胎的着床与发育提供一个良好的条件。
1.2 子宫内膜损伤后病理性修复
1.2.1 宫腔粘连 宫腔粘连主要因宫腔相关手术创伤、感染等因素导致子宫内膜基底层损伤，内膜异常修复引起宫腔、宫颈管瘢痕或粘连带的形成[7]。子宫内膜受相关病理性因素损伤后，宫腔表面会出现缺乏上皮细胞覆盖、间质裸露、炎性细胞浸润以及胶原沉积等情况，进而造成内膜纤维化，最终形成宫腔粘连。目前关于宫腔粘连的发病机制尚未明确，有创伤学说、神经反射学说和细胞因子学说等[8]，其中创伤学说被认为是宫腔粘连发生的最主要因素[9]。遭受创伤后的子宫内膜上皮层修复发生障碍，间质裸露导致促纤维化细胞因子分泌增多，过度的成纤维细胞增生导致内膜增殖障碍和血管再生障碍，并最终沉积形成瘢痕。因此，宫腔粘连的发病机制实际即为子宫内膜的纤维化。损伤后的内膜上皮细胞再生延迟，腺体数量减少并呈囊性或无活性扩张，导致其容受性下降，从而影响胚胎或受精卵的着床和植入，最终造成女性反复流产或不孕[10]。
1.2.2 薄型子宫内膜或难治性子宫内膜 子宫内膜厚度是目前临床上反映子宫内膜容受性的相关指标，并且也是胚胎移植后妊娠结局的一个预后因素，其正常范围为5～10 mm[11]。相关研究表明，子宫内膜厚度≤7 mm可能导致低妊娠率[12]，而临床上有些重度宫腔粘连及严重子宫腺肌病等患者的子宫内膜厚度始终≤7 mm，故将此类子宫内膜称为薄型子宫内膜。虽然目前临床上此类内膜发病率不高，仅为2.4%左右，但却严重影响女性的生育能力[13]。目前薄型子宫内膜的治疗手段主要集中于外源性雌激素补充和宫腔内灌注低剂量阿司匹林、枸橼酸西地那非、左旋精氨酸等，但均无法从根本上解决内膜再生的问题[14]。间充质干细胞的无限自我更新及多潜能分化特性，使其在子宫内膜修复领域的优势突显。
2.1 骨髓间充质干细胞
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是研究发现最早的一类MSC，已广泛应用于治疗各类疾病，其中包括子宫内膜损伤再生修复。相关在体实验研究发现，在对子宫内膜损伤动物模型进行BMSCs治疗时，随着内膜增厚，子宫内膜容受性的标志物整合素β3和白血病抑制因子(LIF)以及抗炎细胞因子IL-6的表达量也相应上调[15-16]。林彤等[17]通过宫腔注射BMSCs发现，大鼠体内整合素β3、波形蛋白以及角蛋白均有不同程度上调，而波形蛋白主要用于维持间质细胞结构稳定，角蛋白则主要用于维护上皮细胞形态完整性。除此之外，Alawadhi等[18]还发现，当小鼠子宫内膜受损时，静脉注射BMSCs可见其归巢至子宫内膜受损处，从而参与内膜再生修复，该过程不受卵巢激素的影响。由此可见，BMSCs可通过向上皮细胞分化、维护上皮细胞形态完整性、提高子宫内膜容受性以及归巢，从而发挥修复受损内膜的作用。由于目前技术有限，骨髓内BMSCs含量较低，导致其取材困难、移植易感染，从而限制了BMSCs的临床应用。
2.2 脂肪间充质干细胞
脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells，ADMSCs)来源于机体的脂肪组织，具有较高活性；
与BMSCs相似，具有一定的分化能力，除此之外，它还具有取材方便、来源广泛以及增殖速率快等优点，目前主要应用于细胞再生以及损伤修复等方面的疾病研究。在子宫内膜损伤方面，有相关研究表明[19]，宫腔粘连模型雌鼠移植雄鼠ADMSCs后，雌鼠体内增殖细胞核抗原、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等多种细胞增殖标志物的表达均上调。除此之外，Gugjoo等[20]还发现，移植ADMSCs可促进马子宫内膜的组织微环境重构。尽管ADMSCs存在一些问题，如分化能力的个体差异以及活性随年龄降低等，但因其数量充分，相关实验技术成熟，并且对于子宫内膜损伤患者来说，能够实现自体细胞移植。由此显示，ADMSCs在子宫内膜修复领域具有不错的发展潜力。
2.3 脐带间充质干细胞
脐带间充质干细胞(umbilical cord mesnchymal stem cells，UCMSCs)起源于胚胎时期的中胚层，属于一类成体干细胞。目前，UCMSCs移植研究多集中于脊髓损伤、心脏损伤以及脑损伤等疾病[21]。在子宫内膜损伤修复研究中，Zhang等[22]通过尾静脉注射UCMSCs，发现薄性子宫内膜模型大鼠纤维化标志物(TGF-β)下调，而血管标志物(VEGF、基质金属蛋白酶9)、细胞增殖和促炎标志物(肿瘤坏死因子-α、干扰素γ)以及间质和上皮标志物(波形蛋白、角蛋白)表达有所上调。贺桑等[23]根据动物实验也得出同样结论，发现移植UCMSCs的薄性子宫内膜模型大鼠子宫间质增厚，大量血管新生和腺体增生，而纤维化程度降低。目前UCMSCs的相关性研究尚处于基础研究阶段，临床研究方面多数是联合组织工程进行治疗。Xu等[24]将脐带血管周围间充质干细胞附着于智能生物材料置入子宫内，基质金属蛋白酶9表达上调，从而促进子宫瘢痕血管、肌层和内膜再生。
2.4 人羊膜间充质干细胞
人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)具有多向分化的潜能，体外可诱导向成骨、脂肪、内皮、神经细胞以及肝细胞分化，因其取材方便、来源丰富、低免疫原性以及不涉及伦理等优点，已成为目前再生医学领域中的新移植细胞来源。Gan等[25]通过动物实验发现，hAMSCs可促使宫腔粘连大鼠进行子宫内膜修复，降低炎性因子表达，增加抗炎因子IL-6以及碱性成纤维细胞生长因子表达，从而使子宫内膜增厚和腺体增多，并减少其纤维化组织。
2.5 月经血间充质干细胞
月经血间充质干细胞(menstrual blood-derived stem cells，MenSCs)来源于女性自然脱落而形成的月经排泄，是一种具有较高细胞分化能力的成体干细胞，在外界因素刺激下可分化为心肌细胞、肝细胞、骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。MenSCs的提取过程对于人体来说是非侵入性的，因此，越来越多学者开展对MenSCs的研究以及其在子宫内膜修复中的相关应用。相关临床试验表明[26]，7例重度宫腔粘连患者采用MenSCs治疗后，3例成功妊娠，5例内膜增厚至正常范围。尽管目前MenSCs的临床应用仍存在一些问题，如保存及采集时污染等，但基于自身的治疗潜能及其相关临床试验有待深入研究。
2.6 胎盘间充质干细胞
胎盘间充质干细胞(placental mesenchymal stem cells，PMSCs)也是目前理想的一种成体干细胞来源，其标本获取和UCMSCs一样相对容易，可向神经细胞、肝细胞以及成骨细胞等分化。根据相关研究验证，PMSCs在血管损伤、骨组织修复以及妊娠高血压等方面均有较好的应用前景[27-28]。牛婷等[29]通过注射同种异体PMSCs至雌鼠宫腔内，发现子宫内膜腺体个数较前增多，整合素αγβ3表达上调，由此可见，PMSCs对内膜具有一定的再生修复能力。王香香等[30]通过宫腔移植PMSCs实验发现，PMSCs可通过增加子宫内膜腺体数及其厚度，从而在一定程度上对子宫内膜进行修复，进而提高胚胎着床率。
MSCs外泌体是MSCs的旁分泌产物，与基于MSCs的全细胞疗法相比，除了具备与MSCs相似的生物学功能，还具备易穿透生物屏障、易获取与储存、稳定性强、致瘤性、免疫原性和药理毒性低以及不涉及伦理等优势。此外，因外泌体中包含多种遗传物质，使其在促进组织修复的过程中，能发挥更佳的疗效[31]。目前研究表明，MSCs外泌体在神经系统疾病、心血管疾病以及相关组织修复领域中疗效显著[32-33]。因此，深入研究MSCs外泌体在子宫内膜修复领域中的作用机制，对于今后其临床应用具有十分重要的意义。
3.1 抗炎与免疫调节
相关研究表明，MSCs具有一定的抗炎和免疫反应的作用，故其外泌体也具备类似功效[34]。研究显示，ADMSCs外泌体可通过降低转录因子、干扰素γ以及上调免疫细胞因子表达，从而减轻局部炎症反应来发挥免疫调节作用[35]。Zhao等[36]研究发现，ADMSCs外泌体可转移至巨噬细胞，促进IL-10以及M2相关精氨酸酶1的表达，从而诱导促炎性巨噬细胞转化为抗炎性M2型巨噬细胞，进而抑制巨噬细胞的炎性反应。此外，研究发现，通过BMSCs外泌体干预宫腔粘连模型大鼠，其可通过减少炎性细胞因子释放，从而促进大鼠子宫内膜修复[37]。由此可见，充分利用外泌体的运输特点以及MSC外泌体中抗炎成分的治疗作用，将成为子宫内膜修复的一种有效手段。
3.2 血管生成
血管生成在子宫内膜再生修复过程中起重要作用。MSCs可通过释放包含促血管生成的外泌体来促进血管内皮细胞增殖[38]。有关研究表明，ADMSCs外泌体内含有与血管生成相关的miRNA，如miR-126、miR-132等，其通过促进生长因子的表达如表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子等，从而促进血管生成[39]。赵双丹[40]在ADMSCs来源的外泌体治疗宫腔粘连模型大鼠有效性的研究中发现，ADMSCs来源的外泌体较ADMSCs能明显增加模型大鼠血管内皮生长因子的表达，从而促进血管再生，改善和修复受损的子宫内膜形态，提高合笼后妊娠率及缩短受孕时间。常琦圆[41]发现，MenSCs来源的外泌体具有损伤趋向性，移植后可迁移至子宫内膜病变部位，促进内膜的腺体新生，增加子宫内膜和肌层的血管分布，有效修复受损内膜，提高宫腔粘连大鼠的子宫内膜容受性，恢复其生育能力。另外，有关研究表明，外泌体的内容物及其浓度随其周围环境的改变而发生变化[42]。Han等[43]发现，经过低氧预处理的ADMSCs外泌体，其促血管形成能力显著提升。因此，后续临床应用可通过对MSCs外泌体进行相关预处理，从而增加其疗效。
3.3 细胞增殖与凋亡
细胞增殖与凋亡在子宫内膜再生修复中尤为重要。根据已有研究显示，MSCs外泌体可通过相关机制影响细胞增殖与分化。吕承晓等[44]研究发现，UCMSCs外泌体及其处理后的子宫内膜基质细胞内miR-21-5p表达水平显著升高，抑制miR-21-5p表达后，子宫内膜基质细胞增殖活性降低，表明UCMSCs来源的外泌体通过转运miR-21-5p能够参与调控多种与子宫内膜再生修复相关的基因表达及信号通路，从而有效促进子宫内膜基质细胞增殖，加速受损子宫内膜的再生修复进程。研究发现，子宫内膜损伤的模型小鼠经过UCMSCs外泌体治疗后，子宫内膜基质细胞Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白和血管内皮生长因子表达水平显著升高；
Akt酸化水平显著增加，PTEN蛋白表达显著下降[45]。由此提示，UCMSCs外泌体通过激活PTEN/Akt通路，调控Bcl-2家族以及血管生成相关因子的表达，从而调控细胞增殖和凋亡，有效增加子宫内膜的厚度和腺体数量，促进血管再生，显著改善小鼠受损的子宫内膜。由此可见，MSCs外泌体可抑制细胞凋亡和促进细胞增殖，在损伤的子宫内膜修复中发挥积极作用。
3.4 抑制上皮间质转化
子宫内膜上皮细胞转化为间质细胞，大量纤维沉积在子宫内膜表面，从而导致内膜功能层受损，最终造成宫腔粘连。由此可见，抑制上皮间质转化在子宫内膜修复过程中有着十分重要的意义。相关研究表明[46]，BMSCs可逆转TGF-β1诱导的宫腔粘连新西兰兔子宫内膜中的上皮间质转化过程，同时通过调控TGF-β1/转录调节因子Smad3信号轴促进其子宫内膜损伤后的修复过程。另外，Xiao等[47]通过实验对BMSCs外泌体抑制内膜纤维化的作用机制进行深入探讨，结果表明，损伤子宫内膜局部释放BMSCs外泌体，携带并转运miR-340至毗邻的内膜间质细胞中，从而发挥逆纤维化和无瘢痕修复的治疗作用。
近些年来，随着人们对MSCs的不断深入研究，国内外已有大量相关文献证实其对子宫内膜修复的有效性，但仍存在局部定植率低等问题。MSCs联合支架复合物可一定程度上提高MSCs移植效率。目前组织工程领域中常见的支架材料有水凝胶[48]、胶原[49]和羊膜[50]等。水凝胶是一种可注射的细胞支架，吸水性较好，是MSCs移植的优选材料。Yang等[51]将BMSCs和水凝胶按照一定比例混合后注入宫腔粘连模型大鼠子宫内，发现相较于对照组，前者的腺体数增多，内膜厚度增加。Ding等[16]通过将大鼠BMSCs移植至可降解胶原上，发现其不会影响BMSCs相关基因表达，并且在一定程度上可促进BMSCs增殖、迁移及附着。Cao等[52]亦通过一项前瞻性临床观察证实了UCMSCs/胶原支架对宫腔粘连患者的显著效果，且无不良反应。羊膜目前已成熟应用于皮肤损伤和角膜疾病的治疗，而在子宫内膜修复领域，吴林[53]研究发现，相较于对照组，羊膜联合UCMSCs治疗中重度宫腔粘连患者可降低其宫腔镜粘连术后AFS评分，促进子宫内膜增厚。由此证实，羊膜负载MSCs将有望成为子宫内膜损伤后修复的新型支架材料。由此可见，MSCs联合组织工程将是今后治疗子宫内膜损伤后修复的一大热点。
5.1 PI3K/AKT信号通路
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinotidol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)是机体内一条关键的信号转导途径，已证实在多种生物学过程中发挥着重要作用，如细胞增殖、凋亡、炎症反应以及血管生成等[54]，对恢复子宫内膜周期性变化具有十分重要的意义。PI3K在受到上游激活信号刺激后，其胞膜上的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)会转化成第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3)，并作用于靶基因AKT；
PIP3与AKT相结合并活化AKT，传递信号至下游效应分子，进而调节并介导激活下游多种激酶，影响细胞的分化和代谢，最终对子宫内膜损伤后修复起到治疗作用[55]。
Wang等[56]将MSCs外泌体与损伤后内膜基质细胞共培养，证实MSCs外泌体通过激活PTEN/AKT信号通路，并上调Bcl-2、下调Caspase-3，从而促进受损的内膜基质细胞增殖和抑制内膜基质细胞凋亡。张胜辉[57]则发现，MenSCs可通过调控PI3K/AKT信号通路改善乙醇诱导的子宫内膜损伤，并通过降低促凋亡蛋白(PUMA和Bax)以及增加抗凋亡蛋白(Bcl-xl、Bcl-2)表达来抑制子宫内膜凋亡。董柳[58]同样通过实验发现，UCMSCs外泌体可通过抑制PTEN，激活AKT活化，进而激活下游的相关因子，并且Bcl-2表达上调，Caspase-3表达下调，最终证实UCMSCs外泌体通过调控PI3K/AKT信号通路来控制下游凋亡蛋白表达。除此之外，Wang等[59]研究表明，ADMSCs外泌体可通过调控PI3K/AKT信号通路，促进TGF-β1、基质金属蛋白酶3表达，进一步激活ERK/MAPK信号通路，抑制成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并促进ECM重塑，从而拮抗瘢痕形成。Zhang等[60]通过实验发现，MenSCs可通过AKT信号通路促进血管形成，从而修复子宫内膜。由此可见，在MSCs修复损伤后子宫内膜的过程中，PI3K/AKT信号通路主要通过调节内膜基质细胞增殖凋亡、抑制上皮间质转化、促进ECM重塑以及促进血管形成，从而发挥对子宫内膜的修复作用。见图1。
图1 间充质干细胞修复子宫内膜介导
5.2 TGF-β1/Smad3信号通路
TGF-β1/Smad3信号通路是一条多功能的信号传导途径，其参与生物体多种生理过程，如细胞增殖分化以及干细胞多能性等。在经典TGF-β通路中，TGF-β与成纤维细胞上的特异性受体相结合，导致Smad2/3磷酸化，并与Smad4结合形成异聚体复合物，转运至细胞核内，从而刺激基质蛋白转录，促进ECM沉积，并抑制基质金属蛋白酶活性，减少ECM降解，最终促使纤维化的形成[61]。
Yao等[46]通过离体实验发现，过表达miR-34a的BMSCs外泌体可通过激活TGF-β1/Smad3，下调TGF-β1表达，上调波形蛋白、E-钙黏蛋白表达，从而逆转上皮间质转化来修复子宫内膜。Li等[62]研究则证实，过表达miR-29b的BMSCs外泌体可通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路，从而降低胶原Ⅰ型α1和α-肌动蛋白的表达，从而抑制子宫内膜间质纤维化。另外，肖向阳等[63]研究表明，ADMSCs外泌体可通过调控TGF-β1/Smad3信号通路相关因子以及凋亡相关蛋白(促进凋亡相关蛋白表达、抑制抗凋亡相关蛋白表达)，从而抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖。由此可见，针对性抑制TGF-β1/Smad3所调控的纤维化过程，可有效修复损伤后子宫内膜的瘢痕形成。见图2。
图2 间充质干细胞修复子宫内膜介导TGF-β1/Smad3
5.3 其他信号通路
除了PI3K/AKT和TGF-β1/Smad信号通路，Hippo、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)以及VEGF信号通路在MSCs修复子宫内膜过程中也发挥着重要作用。Hippo通路参与细胞生长、组织再生以及控制器官大小等生物过程。在内膜损伤修复过程中，ECM蛋白的过度积累可导致组织硬度增加，刺激Hippo通路Yes关联蛋白(Yes-associated protein，YAP)[64]，活化的YAP又反过来上调ECM沉积，从而形成正反馈；
同时，YAP还影响其转录靶点结缔组织生长因子和TGF-β，从而调控组织结构重塑[65]。张斯文[66]通过离体实验结果表明，MenSCs可显著降低YAP和结缔组织生长因子的表达，从而对宫腔粘连患者起到一定的治疗作用。Wang等[67]将人脐静脉内皮细胞置于MenSCs条件培养液中，发现MenSCs条件培养液可通过激活ERK通路，提高人脐静脉内皮细胞中VEGFA、VEGF受体1(VEGF receptor 1，VEGFR1)和VEGFR2的表达，促进血管生成，从而起到抗宫腔粘连的作用。Shi等[68]将MSCs与受损内膜基质细胞进行共培养，发现Circ6401与miR-29b-1-5p结合进而促进VEGF信号通路关键蛋白RAP1B的表达，进而促使血管生成，并进一步刺激内膜基质细胞增殖。见表1。
表1 间充质干细胞修复子宫内膜相关信号通路的调控机制
随着MSCs研究的不断深入，无论是基础实验还是临床试验，结果均显示，采用来自骨髓、脂肪、脐带、人羊膜、月经血以及胎盘的MSCs，对子宫内膜修复皆具有显著疗效。MSCs可以分泌外泌体单独或联合组织工程的形式，在抗炎与免疫调节、促进血管生成、调控相关细胞增殖与凋亡以及抑制上皮间质转化方面发挥修复作用。目前主要研究多集中于PI3K/AKT和TGF-β1/Smad3信号通路；
此外，Hippo、ERK以及VEGF信号通路也有部分研究进行探讨。但是，也存在一些局限性，如目前MSCs在子宫内膜修复中的相关性研究多集中于调控细胞因子方面，故未能对不同信号通路间的交互作用进行阐述；
此外，由于目前技术限制，未能对MSCs修复子宫内膜的具体方式进行阐述，如MSCs如何安全有效地收集、具体的作用方式以及其安全隐患等。
损伤后子宫内膜修复的调控机制较为复杂，目前无论是药物治疗还是手术治疗均未取得较为满意的效果。MSCs来源广泛、免疫原性低、易于获取，且可分泌相关细胞因子促进损伤组织修复，因此，具有十分广阔的应用前景。此外，基于现有的相关生物信息学分析结果，有待深入并扩展MSCs在子宫内膜修复中的其他通路研究；
后续研究应明确各类MSCs在子宫内膜修复中的侧重点，并进行深入探讨；
临床应用中，为达到最佳的治疗效果，需对MSCs注射时机、注射部位、运输方式以及安全性等进行深入研究。