张 钰，邓学梅，廖晨星，刘国世*
1 中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193 2 中国农业大学三亚研究院，海南三亚 572025 3 北京首农食品集团有限公司，北京 100028
褪黑素（Melatonin，MLT）又称N-乙酰-5-甲氧基色胺，是一种广泛分布在微生物及动植物体内的吲哚类激素。褪黑素是由Lerner等人于1958年从松果体组织中分离发现，在人们最初的认知中，动物体内仅有松果体能够分泌褪黑素，且功能上仅限于调节个体的昼夜节律以及季节信号。但是在随后的几十年间发表的研究结果表明，大部分的器官组织都能够合成褪黑素，例如视网膜、胃肠道、性腺等[1]。而且褪黑素还具有调节机体免疫和广谱抗氧化功能，能够减少生殖系统及其他组织器官受到的氧化应激、炎症损伤以及细胞凋亡的发生[2]，并根据机体不同的发育阶段和外界环境的季节变化表现出相应的促进或抑制发情的功能，调节生殖系统活动，改善动物的繁殖能力。本文综述了褪黑素在生物机体内合成途径及分泌调控机制、抗氧化和免疫调节机制以及对动物生殖系统、胚胎发育和繁殖能力的影响，以期为后续动物辅助生殖技术的发展提供新的思路与见解。
虽然多种组织器官都能够分泌褪黑素，但只有松果体和眼部的视网膜组织能够呈现周期性的分泌活动，其生物合成受到外界光照条件呈现出昼夜节律性以及季节特征。功能上，褪黑素能够链接外界光照信号变化和机体内多种生理活动节律[3]，对神经系统具有良好的保护作用，能够调节昼夜节律变化并对精神疾病具有良好的治疗效果[4]。此外褪黑素还具有广谱抗菌作用[5]以及免疫调节功能[6]。
1.1 褪黑素的生物合成
褪黑素最初是从动物体内的松果体分离并鉴定[7]，但随着研究的深入，有研究者发现肠道和卵泡等多种组织器官也能够合成褪黑素[1]，并作为自分泌和旁分泌信号调节生理活动。脊椎动物的胃肠道色氨酸作为褪黑素生物合成的前体被小肠吸收进入血液循环，松果体细胞主动摄取，经过色氨酸羟化酶作用形成5-羟基色氨酸，再经过芳基烷基胺-N-乙酰转移酶（AANAT）转化为N-乙酰血清素，最后在乙酰血清素O-甲基转移酶（ASMT）的作用下成褪黑素[8]。在这个过程中，AANAT是主要的限速酶，其生物活性能够调控褪黑素的合成速度。AANAT基因中的调节/结合序列能够编码cAMP操作的结合开关，cAMP调节的蛋白激酶催化的磷酸化促进与14-3-3蛋白质复合物的形成。这种AANAT/14-3-3复合物的形成通过屏蔽AANAT的去磷酸化或蛋白水解，并降低血清素的K（m）来增强褪黑激素的产生[9]。Yalikun S等[10]的研究进一步确定褪黑素是在线粒体基质中合成的。松果体合成褪黑素后迅速释放至血液及脊髓液中[11]，与血浆蛋白结合并分布到大多数身体组织中[12]发挥作用。
另一方面，有许多研究指出，部分细菌和真菌[13]也具有合成褪黑素的能力。Tilden等[14]通过控制光照条件，发现一株需氧光合细菌-长红杆菌在光照较弱的条件下能够合成并分泌褪黑素，但是自然状态下的微生物合成褪黑素的效率及浓度较低，不能满足将其分离提纯及应用的需求。随着微生物基因组、基因工程技术和发酵工程的发展，越来越多的研究利用经过基因工程技术培养的工程菌合成一些具有较高价值或者难以人工合成的物质[15]。利用工程菌发酵转化物质，具有方便快捷、安全高效，降低成本等特点。其中大肠杆菌是研究人员常用的宿主菌，部分大肠杆菌的质粒能够编码T7溶菌酶，能够大量表达目的蛋白，而且能够抑制宿主自身蛋白的正常表达[16]。有研究人员利用基因工程技术，将油菜黄单胞杆菌携带的苯丙氨酸4-羟化酶（P4H）、水稻携带的咖啡酸3-O-甲基转移酶（COMT）基因以及白链霉菌的藻毒素合成基因构建载体后导入到大肠杆菌中，并利用蛋白质工程和代谢工程技术，成功地让大肠杆菌大量表达褪黑素[17]。
1.2 褪黑素的生物学功能
1.2.1 褪黑素调节生物节律
褪黑素具有调节动物昼夜节律的功能[18]，在夜晚，光照条件较弱的条件下，内源性褪黑素大量合成，促进并改善睡眠质量。而在白天，受光照刺激，松果体分泌褪黑素会受到抑制[4]。有研究指出，外界光照条件变化能够通过局部视觉器官（IOP）影响松果体合成并分泌褪黑素的水平，进而调机体的睡眠状态[19]。这提示，机体通过视觉器官感受外界光照变化，并将信号传递至松果体，由松果体将视觉器官传递来的光照变化信号转变为褪黑素信号，从而调节机体的昼夜节律。Zhang等[20]通过基因编辑技术构建褪黑素上调的下调的小鼠模型，发现褪黑素上调的小鼠睡眠时间要明显高于褪黑素下调的小鼠，试验结果充分说明了褪黑素对机体昼夜节律的调节作用。
1.2.2 褪黑素调节机体免疫
褪黑素具有免疫调节功能，在不同的炎症情况下能够表现出促炎作用和抑炎作用，能够提高机体对外源或内源抗原的抵抗力以及恢复力[21]。在血液中，褪黑素能够刺激单核细胞产生活性氧（ROS），而适度产生的ROS能够激活其他免疫细胞[22]，促进机体免疫系统发挥防卫功能。有研究指出，褪黑素能够作用于人单核细胞U937的细胞膜表面的褪黑素受体1和褪黑素受体2（MT1、MT2），刺激胞内产生活性氧，并且产生的活性氧浓度不会造成细胞的氧化应激损伤[23，24]。激活后的单核细胞能够分化为巨噬细胞并合成趋化因子以及相关炎症因子从而发挥免疫调节功能。在其他研究中，褪黑素能够作用于免疫细胞的细胞膜表面的MT1，从而上调白细胞介素2（IL-2）受体的表达，并缓解前列腺素对IL-2的抑制作用[25]。另一方面，褪黑素在机体处于严重炎症的情况下能够表现出抑制炎症的作用。由研究人员利用右旋糖酐硫酸钠（DSS-）诱导小鼠神经炎症和肝损伤，通过给予外源性褪黑素后，能够增加短链脂肪酸的合成，缓解小鼠的神经炎症[26]。同时，褪黑素还能抑制小鼠肠道中法尼素X受体成纤维细胞生长因子15（FXR-FGF 15）和肝脏中凋亡信号调节激酶1（ASK1）的过度激活，缓解肠道炎症以及肝脏代谢紊乱。
1.2.3 褪黑素的抗氧化作用
褪黑素具有广谱抗氧化活性[6]，能够通过清除多余自由基、刺激内源性抗氧化酶和提高其他抗氧化剂的效率等多种机制[27]限制氧化损伤。进一步说，褪黑素能够通过氢原子转移（Hydrogen Atom Transfer，HAT）、质子耦合电子转移（Proton Coupled Electron Transfer，PCET）、自由基加和物（Radical Adduct Formation，RAF）、单电子转移（Single Electron Transfer，SET）、序贯电子质子转移（Sequential Electron Proton Transfer，SEPT）等机制直接清除机体内过氧基（Peroxyl Radical，ROO）、羟基自由基（Hydroxyl Radical，OH）、氨氧基（Nitric Oxide，NO）等自由基[28]。Mekhloufi等[29]在体外构建脂质模型，并检测褪黑素与氢过氧化物的清除作用，试验结果表明，褪黑素能够直接与羟基自由基发生反应并进行清除。褪黑素还能够螯合Cu2+、Fe2+、Zn2+、Al3+和Mn2+等有毒金属离子[30]，降低金属离子催化的分子损伤并抑制其与β-淀粉样肽相互作用产生自由基[31]，间接发挥对机体的抗氧化及保护作用。有研究指出，褪黑素对Cu2+介导的脂质过氧化[32]以及Cu2+/H2O2诱导的金属催化氧化（Metal-Catalyzed Oxidation，MCO）和蛋白质损伤[33]具有保护作用。此外，褪黑素还能通过电子转移的过程增加谷脱甘肽、抗坏血酸和水溶性维生素E的抗氧化作用[34]。
褪黑素能够作用于“下丘脑-垂体-性腺轴”调控动物的繁殖活动[35]，对动物的生殖具有多方面的影响。在未成熟动物体内，褪黑素能通过抑制内源性GnRH的分泌[36]来抑制其性成熟、自发性排卵和发情反应[37]，在成熟动物体内，褪黑素又能起到一定的促进作用[38]。这种现象在一定程度上说明褪黑素对于未成熟动物具有一定的保护作用，防止其由于过早参与繁殖活动，造成生殖系统及其他组织器官的损伤。另一方面，在哺乳动物中，下丘脑视交叉上核能够通过视网膜下丘脑束接收光刺激，从而调节松果体合成并分泌褪黑素的节律性。褪黑素主要在在夜间分泌，分泌量与白天日照时间长短成反比。通过这种方式将光周期信号转变为动物体内褪黑素含量的变化，从而调节季节性发情的动物的繁殖周期[39，40]。
2.1 褪黑素对雄性生殖系统的影响
褪黑素能够显著改善雄性生殖系统的状态，并且MT1和MT2能够介导除褪黑素之外的其他激素信号，并上调睾丸激素水平[41]。在胚胎和幼年阶段，褪黑素能够通过与睾丸组织中的MT1和MT2结合，促进雄性激素的分泌以及生殖系统的发育和成熟[42]。在成年后，褪黑素能够促进雄性激素的分泌以及精子的形成，并促进季节性发情动物进行繁殖活动[43]。此外，褪黑素固有的抗炎作用以及抗氧化作用对雄性生殖系统也有帮助。有研究报道，褪黑素能够提高冷冻保存的精原干细胞（SSCs）的存活率，减少由于冻融过程中细胞内产生的ROS[44]。另一方面，褪黑素对雄性动物生殖疾病有良好的预防及治疗作用。由革兰氏阴性细菌引发的睾丸炎会抑制雄性激素的合成以及精子的发生，其细胞壁中的脂多糖（LPS）能够与toll样受体4结合并引起机体免疫系统做出反应。而褪黑素能够增强睾丸中巨噬细胞的吞噬能力，并抑制p38 MAPK通路和促进Leydig细胞睾酮分泌来抑制TM促炎因子的分泌，从而抑制炎症反应[45]。
2.2 褪黑素对雌性生殖系统的影响
微观上，褪黑素通过下丘脑-垂体-性腺轴调控畜禽的生殖激素的分泌，主要是GnRH和LH。有研究表明，外源褪黑素能够上调脑部GnRH-1、GnRH-3和几种GnRH受体的转录水平，且相同剂量下这种影响的程度受到外界光照条件的影响。这表明外源性褪黑素加强了已经建立的GnRH系统的生理机制。另有研究表明，在雌性小鼠切除卵巢后能增加松果体分泌的褪黑激素的含量。但是在雄性小鼠体内没有观察到这种现象。这表明GnRH可能参与调节成年雌性大鼠松果体褪黑激素的分泌[46]。
雌性动物在排卵的过程中，线粒体能够合成大量的褪黑素，不仅能够清除因各种途径产生的活性氧（ROS），还能够促进卵母细胞的成熟，在一定程度上提高畜禽的繁殖性能。Tian等[47]采用放射免疫法测定牛卵泡液中褪黑素的浓度约为10-11M，随后的试验指出补充外源褪黑素能够上调GDF9、MARF1、DNMT1a等卵母细胞成熟基因和PTX3、HAS1/2等卵囊扩张相关基因，促进卵母细胞成熟。Tao[48]等通过构建猪颗粒细胞（GCs）缺氧模型，并用褪黑素进行处理，发现褪黑素能够降低ROS水平并提高超氧化物歧化酶1（SOD1）等抗氧化酶的表达、抑制GCs中caspase-3的激活、提高GCs的活力并减少凋亡。
畜禽在妊娠过程中容易产生妊娠并发症导致子宫内炎症及自噬，褪黑素能够抑制炎症状态下的IL-10、TNF和IL-6水平的升高[49]，改善妊娠过程。Lee等[50]对妊娠小鼠给予外源褪黑素，也得到了相似的结果。在畜禽的辅助繁殖技术方面，褪黑素能够上调减数分裂后期标记基因Dnmt3a和Bcl-2的表达并下调Bax表达，从而促进精原干细胞向功能精子的分化[51]。刘佳慧等[52]在体外条件下用1 nmol/L褪黑素处理未成熟的猪卵母细胞，发现可显著改善卵母细胞成熟质量，抑制多精受精的发生。
2.3 褪黑素对早期胚胎发育的影响
褪黑素不仅能够影响雌雄配子的形成，还能进一步影响早期胚胎的发育。褪黑素能够增加囊胚期细胞内mt RNA 拷贝数、线粒体膜电位和线粒体的分布，抑制p53、Bax等凋亡基因表达并促进SOD1、GPx4等抗氧化基因的表达，从而改善囊胚期胚胎线粒体功能，促进早期胚胎发育并提高囊胚质量[53]。MT1在胚胎发育早期就已经开始表达[54]，MT1在未卵裂的激活卵母细胞中主要分布于细胞膜上，随着孤雌胚胎卵裂的进行，受体表达量逐渐增加，主要表达定位于细胞膜上，随着胚胎发育的进行，MT1在卵裂球内部开始表达和分布，退化胚胎中MT1表达水平较低。王凯娟等[55]研究发现用10-9mol/L的褪黑素处理IVF受精后的卵泡，能显著提高囊胚形成率以及优质囊胚率，提高胚胎质量。佟桂芝等[56]在牛体外胚胎生产全程添加不同浓度梯度的褪黑素，发现10-9mol/L的褪黑素能够显著提高牛卵母细胞卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数。此外，在胚胎附植过程中，褪黑素能够结合MT2受体，促进子宫内膜接受态的建立。研究发现，在妊娠早期小鼠子宫内褪黑素合成限速酶AANAT的表达量增加，且妊娠第二天的子宫腔上皮细胞和子宫腺中MT2受体特异表达[57]。注射补充15 mg/kg剂量褪黑素后，小鼠子宫内膜厚度以及子宫腺密度上升，且着床部位的数量和窝仔数显著上升。
2.4 褪黑素对乳腺泌乳的影响
动物幼崽在刚出生的一段时间内，机体无法合成内源性褪黑素[58]，需要通过摄入母乳中的褪黑素来调节自身生物节律并促进免疫系统发育。因此，哺乳期母乳中的褪黑素含量对于幼崽的早期发育至关重要。马腾等[59]构建绵羊羊褪黑素合成限速酶基因AANAT和HIOMT的线性化表达载体，结合输卵管移植术，成功构建过表达褪黑素合成酶的转基因羊模型，且母乳中褪黑素含量显著升高。杨爱玲等[60]对该转基因羊模型的生长性能、多项生理指标以及乳成分进行分析，结果显示与空白对照组绵羊无明显差别，仅褪黑素和乳糖含量升高、体细胞数含量降低，推测原因可能是乳腺中的褪黑素含量上升，发挥其免疫调节功能降低了乳中体细胞数。
褪黑素是连接外界光照条件变化与体内生理活动变化的关键信号分子，动物眼睛的视网膜接收光照信号变化后将信号传递给松果体，随后松果体将光照信号转化为褪黑素，从而参与机体内各项生理反应。褪黑素能够从多角度调节机体抗氧化和免疫反应，并以此改善动物的繁殖性能。随着动物辅助生殖技术的发展，人们对于动物繁殖过程中的各种生理变化更加熟悉，也发现越来越多限制动物繁殖性能的问题，前人的研究已经充分显示褪黑素对于提高动物繁殖性能的作用，或许可以作为未来解决动物辅助生殖的关键因素。但是对于不同物种或品种动物，褪黑素及其异构体的给药方式仍需进一步研究。
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