郝剑 韩磊
河北北方学院附属第一医院1检验科，2胃肠外科（河北张家口075000）
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是我国第三常见的恶性肿瘤［1］。早期CRC 患者经有效治疗后5年生存率可以超过90%，但约1/4 的患者在初诊时已发生局部或远处转移，其5年生存率仅为约12%［2］。早发现、早诊断、早治疗是目前公认的能够有效提高CRC 治疗疗效的策略，目前临床常用的实验室诊断检测主要有粪便潜血检测和血液标志物检测，但二者敏感性和特异性不足［3］；
影像学检查可以有效评估病变范围和肿瘤分期，但对早期病变的诊断价值有限［4］；
内镜联合组织活检是目前早期诊断CRC 的金标准，但存在操作繁琐、患者依从性差、侵入性强等缺点［5］。因此，临床实践中迫切需要一种微创或无创、灵敏且准确的早期诊断方法。液体活检技术因其无创、全面、实时、可重复监测等特点而备受推崇。外泌体miRNA 是目前液体活检的主要项目之一，其在肿瘤的早期诊断、疗效评估和预后评估方面具有潜在的临床应用价值［6］。一项研究发现，原发性早期CRC 患者血清中多个miRNAs 的含量明显高于健康组，提示其可作为潜在的CRC 早期诊断标志物［7］。既往研究报道miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 与CRC 的恶性生物学行为密切相关［8-11］，但关于4 种miRNA 的表达水平及其对CRC 患者的诊断价值的研究相对较少。因此，本项研究旨在评估上述4 种外泌体miRNA 在CRC 患者外周血中的表达情况，并评估其对CRC 的诊断价值。
1.1 一般资料选取2018年3月至2022年5月本院收治的123 例结直肠癌患者（结直肠癌组）及117 例结直肠腺瘤患者（结直肠腺瘤组）作为研究对象，并纳入150例健康对照者作为对照（健康对照组）。受试者入组后收集其年龄、性别、吸烟、肿瘤部位、肿瘤大小等相关信息。结直肠癌组纳入标准包括：（1）手术病理确诊；
（2）未接受放疗、化疗或其他肿瘤相关治疗。排除标准包括：肝、肾和其他器官功能障碍的患者。结直肠腺瘤（colorectal adenoma，CA）患者纳入标准包括：通过肠镜病理学确诊。排除标准包括：无肿瘤病史，无其他肠道疾病，无肝、肾或其他器官功能障碍。健康对照组纳入标准：肠镜检查肠道内未发现异常。排除标准包括：肿瘤病史和心脏、肝脏、肾脏或其他器官功能障碍。本研究经患者之情同意并经本院伦理委员会批准，伦理批号：HBBFYXY202203024。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器与试剂ABI7900 实时荧光定量PCR 仪购自美国Thermo-Fisher 公司，GH8935K Nano sight 纳米粒度仪购自英国Nano-sight 公司，外泌体提取试剂盒Exo-Quick-TM（货号：ND25792-6）、SYBR Premix ExTaq 试剂盒（货号：N5643MJ）购自美国CST 公司，Prime-Script RT reagent 试剂盒（货号：ND6527J）购自购自北京百奥生物科技公司，CD9 抗体（货号：75882）、CD63 抗体（货号：45368）、Calnexin 抗体（货号：6387941）均购自美国CST公司。
1.2.2 血清外泌体提取与鉴定收集受试者5 mL外周静脉血置于不含抗凝剂的试管中，室温下3 000g离心15 min，根据ExoQuickTM试剂盒说明书进行后续操作，涡旋后的血清和外泌体试剂混合物在4 ℃下沉淀30 min，1 500g离心30 min，弃上清液，再次1 500g离心5 min 得到沉淀，重悬于200 μL 磷酸盐缓冲液中，使用0.22 μm 无菌过滤器过滤，制备所需大小和浓度的外泌体。利用纳米粒子追踪分析技术和蛋白质印迹检测外泌体标记蛋白CD9、CD63、TSG101、Calnexin 的表达，对血清外泌体进行鉴定。
1.2.3 qRT-PCR 检测血清外泌体miRNA采用TRizol 法从血清外泌体中提取总RNA。Nano Drop用于检测RNA 的浓度。逆转录体系包括：总RNA 12 μL、2.5 U/μL PolyA 聚合酶1 μL、Mix 1 μL、5×Reaction Buffer 5 μL 和ddH2O 6 μL。以U6 为内参，检测miR-15b、miR-16、miR-21、miR-31 的相对表达量。反应条件为：95 ℃10 min；
然后是95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，共40 个循环。2-ΔΔCt方法用于计算相对表达量，引物序列见表1。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequence
1.3 统计学方法通过SPSS 22.0 统计软件对数据进行分析。符合整正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。采用受试者工作特征曲线（ROC）预测诊断价值，以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 临床特征本研究新诊断结直肠癌患者123例，其中男59 例，女64 例，年龄（51.60 ± 11.41）岁，见表2。同期共入组117 例经视频结肠镜检查确诊为结直肠腺瘤的患者，其中男59 例，女58 例，年龄（51.55 ± 10.17）岁。纳入我院健康对照者150 例为健康对照组，其中男76 例，女74 例，年龄（52.30 ±11.25）岁。
表2 结直肠癌患者临床病理特征Tab.2 Clinicopathological features of patients with colorectal cancer 例
2.2 各组中miR-15b、miR-16、miR-21、miR-31 相对表达水平与健康对照组相比，结直肠癌组miR-15b、miR-21、miR-16 及miR-31 表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与结直肠腺瘤组比较，结直肠癌组miR-15b、miR-21、miR-31 差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。
表3 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 相对表达量Tab.3 Relative expression levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in each group ±s
表3 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 相对表达量Tab.3 Relative expression levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in each group ±s
注：与对照组比较，*P ＜0.05；
与结直肠腺瘤组比较，#P ＜0.05
组别结直肠癌组（n= 123）肠腺瘤组（n= 117）健康对照组（n= 150）F 值P 值miR-15b 11.94± 3.81*#2.45± 0.02 1.21± 0.08 40.16 0.009 miR-16 2.83± 0.33*1.27± 0.12 0.79± 0.33 36.54 0.015 miR-21 8.59± 1.61*#2.14± 0.22 1.27± 0.07 18.36＜0.001 miR-31 7.16± 1.17*#1.68± 0.37 1.22± 0.15 39.12＜0.001
2.3 miR-15b、miR-21、miR-31 水平与结直肠癌患者临床病理相关性Ⅲ～Ⅳ期结直肠癌患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31 水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义（P＜0.05），两组之间miR-16 差异无统计学意义（P= 0.778），见表4。结直肠癌伴淋巴结浸润患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31水平高于结直肠癌不伴淋巴结浸润患者，差异有统计学意义（P＜0.05），两组之间miR-16 差异无统计学意义（P= 0.06），见表5。结直肠癌低分化腺癌患者血清miR-15b、miR-21 及miR-31 水平高于结直肠癌中-高分化患者，差异有统计学意义（P＜0.05），两组之间miR-16 差异无统计学意义（P=0.12），见表6。
表4 不同分期结直肠癌患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比较Tab.4 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different stages of colorectal cancer ±s
表4 不同分期结直肠癌患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比较Tab.4 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different stages of colorectal cancer ±s
组别Ⅲ-Ⅳ期（n=78）Ⅰ-Ⅱ期（n=45）t值P值miR-15b 14.54±0.68 9.04±0.72 12.31 0.006 miR-16 2.26±0.08 1.90±0.12 18.35 0.778 miR-21 10.78±0.09 7.94±0.44 22.11 0.026 miR-31 7.56±0.87 6.16±1.22 13.54＜0.001
表5 结直肠癌伴或不伴淋巴结浸润患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比较Tab.5 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with colorectal cancer with or without lymph node infiltration ±s
表5 结直肠癌伴或不伴淋巴结浸润患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比较Tab.5 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with colorectal cancer with or without lymph node infiltration ±s
组别淋巴结浸润（n = 83）无淋巴结浸润（n = 44）t 值P 值miR-15b 13.69 ± 1.22 7.28 ± 1.32 22.78＜0.001 miR-16 3.06 ± 0.15 2.99 ± 0.22 19.35 0.06 miR-21 11.01 ± 0.02 8.22 ± 0.29 10.25＜0.001 miR-31 8.18 ± 0.37 5.98 ± 1.32 8.91＜0.001
表6 结直肠癌不同分化程度患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比较Tab.6 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different degrees of colorectal cancer differentiation ±s
表6 结直肠癌不同分化程度患者血清miR-15b、miR-16、miR-21 及miR-31 水平比较Tab.6 Comparison of serum levels of miR-15b，miR-16，miR-21 and miR-31 in patients with different degrees of colorectal cancer differentiation ±s
组别中-高分化腺癌（n = 49）低分化腺癌（n = 78）t 值P 值miR-15b 14.09 ± 0.88 6.12 ± 2.19 12.18＜0.001 miR-16 2.66 ± 1.18 2.12 ± 1.56 6.22 0.12 miR-21 10.89 ± 0.17 7.99 ± 0.83 19.51＜0.001 miR-31 9.01 ± 0.13 6.10 ± 1.66 18.22 0.029
2.4 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 对结直肠癌患者的诊断价值采用ROC 曲线评估miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 在结直肠癌中的诊断价值。miR-15b 的AUC 为0.86（0.82～0.91），miR-16、miR-21、miR-31 的AUC 分别为0.58（0.51～0.65）、0.75（0.69～0.81）、0.75（0.68～0.82），4 种miRNA 中评价效力最高的指标是miR-15b，敏感度和特异度分别为81.33%和91.80%，（P＜0.05）；
评价效力最差指标为miR-16，敏感度和特异度分别为42.68%和52.33%（P＜0.05）。进一步采用logistic 分析对miR-15b、miR-21和miR-31组合panel诊断价值进行评估，结果显示三者组合panel 具有更好的敏感度和特异度：91.95%和97.62%（P＜0.01）。见图1。
图1 miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 及组合panel 对结直肠癌患者的诊断价值Fig.1 Diagnostic value of miR-15b，miR-16，miR-21，miR-31 and combined panel in patients with colorectal cancer
在我国CRC 发病率和病死率一直居高不下，且由于早期诊断方法缺乏敏感性和特异性，其总体趋势依然呈上升趋势［12］。miRNA 是由19～24 个核苷酸组成的小型非编码RNA 分子，其通过与靶基因mRNA 的3′端非翻译区结合来触发mRNA 的降解，从而抑制蛋白质翻译以调节基因表达，miRNAs的异常表达与许多肿瘤等疾病密切相关，已证实miRNAs 具有致癌或抑癌活性［13］。外泌体miRNA作为肿瘤基质与肿瘤细胞之间信号交流的重要媒介，几乎参与了肿瘤发生和转移的所有生物学过程［14］。与传统的肿瘤标志物相比，外泌体来源的miRNA 具有较高的敏感性和特异性，检测肿瘤来源外泌体中miRNA 的类型和含量，对肿瘤临床诊断和治疗具有重要意义。一项研究分析了746 例CRC 患者和476 例健康受试者，结果显示miR-21 诊断CRC 的敏感度和特异度分别为72%和85%，证实其具有作为CRC 诊断标志物的良好潜力［15］。
本研究结果显示，miR-15b 是CRC 诊断的潜在生物标志物，且miR-15b、miR-21 和miR-31 组合panel 具有更好的诊断价值，这与之前的研究结果相符。miR-15b 属于miR-15 家族，其位于3q25.33 染色体区域。研究表明，miR-15b 在许多肿瘤中异常表达，例如miR-15b 在舌癌、宫颈癌和胰腺癌细胞中上调，并充当癌基因［16］。miR-15b 的异常表达可用于各种肿瘤的诊断，也可作为复发检测的重要生物标志物。一项研究表明，miR-15b在肝癌复发患者中的表达显著增加，miR-15b 可能与MTSS1 结合以调节细胞周期，而MTSS1 是一种多功能蛋白，在肿瘤发生和发展中起重要作用，MTSS1 的下调可作为肺鳞状细胞癌早期辅助治疗阶段进展的标志物［17］。miR-15b 通过靶向下调MTSS1 表达促进CRC 细胞增殖，抑制miR-15b 可上调MTSS1 表达，从而抑制癌细胞增殖［18］。一项荟萃分析发现，血液中的miR-21 水平可用于检测CRC，其具有良好的敏感性和特异性：血液miR-21的诊断效率高于粪便miR-21，血清标本中miR-21的检测优于血浆标本［19］。许多研究表明，miR-31作为一种致癌物质，可以调节肿瘤的生长、凋亡、转移和化疗耐药，miR-31 的表达增加与CRC 肿瘤的进展有关，提示血清miR-31 可用于CRC 的诊断［20］。此外miRNA panel 作为不同miRNA 的组合，可以提高其检测效率。一项包括1 558 例CRC患者和1 085 例健康受试者的荟萃分析结果显示，循环外泌体的miR-1246 和miR-23a 组合panel 诊断CRC 的敏感度和特异度分别高达95%和92%［21］。
总之，本研究评估了4 种血清外泌体miRNA：miR-15b、miR-16、miR-21 和miR-31 的临床价值，并且我们发现4 种miRNA 在结直肠癌患者外周血中异常表达，且其中的miR-15b、miR-21 和miR-31 表达水平与临床TNM 分期、淋巴结浸润呈正相关，与分化程度呈负相关；
此外相较于单一miRNAs 检测，miR-15b、miR-21 和miR-31 的组合panel 可以更好地区分健康对照组和结肠癌患者，其敏感度和特异度分别为95.06%和94.44%，这对于提高结直肠癌临床诊断效率具有潜在的参考价值。但本研究仍然存在局限性，相对较小的单中心样本量限制了该研究的应用价值，后续将进一步进行完善。
【Author contributions】HAN Lei designed the study,HAO Jian conducted experiments and wrote the manuscript,and HAN Lei revised the manuscript.All authors read and approved the final manuscript as submitted.
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