李鹏平，兰霞斌，黄煜庆
1.温州医科大学附属萧山医院 杭州市萧山区第一人民医院 甲状腺乳腺外科，浙江 杭州 311201；
2.中国科学院大学附属肿瘤医院 浙江省肿瘤医院 头颈外科，浙江 杭州 310005
甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤[1]，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是主要病理类型（占80%以上）[2]。尽管大部分PTC预后良好，但部分高危特征的PTC存在甲状腺外侵犯、淋巴结转移、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B）突变，预后较差[3]，给患者及其家庭带来较大的身心及经济负担。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在多种肿瘤中发挥作用，是潜在的肿瘤标志物或治疗靶点[4]。有研究报道lncRNA NAMA、BANCR和PTCSC3等对甲状腺癌的发生发展有重要作用[5-7]。Lnc-CCDC33-1∶1在甲状腺癌中的作用鲜见报道。本课题组前期通过基因芯片检测初步发现lnc-CCDC33-1∶1在PTC中表达升高[8]。本研究拟进一步扩大样本量，并结合癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas,TCGA）[9]的数据，分析lnc-CCDC33-1∶1与甲状腺乳头状癌临床因素的相关性。
1.1 一般资料
1.1.1 本地队列数据：收集2021年11月至2022年3月杭州市萧山区第一人民医院的120例PTC组织及30例癌旁正常甲状腺组织。所有PTC患者均为初诊病例，其中男38例，女82例。根据lnc-CCDC33-1∶1相对表达量中位数分为低表达组（60例）和高表达组（60例），其中高表达组年龄为（41.8±12.9）岁，低表达组年龄为（44.0±12.6）岁。所有病例均经2位以上病理科医师确诊，组织标本在实验前均储存于液氮中。其中，临床特征中甲状腺外侵犯和多灶性由手术结合病理学报告联合认定，是否远处转移由术前各项检查（包括胸部CT、腹部B超、PET-CT等）判定，TNM分期根据所获取的临床和组织病理学情况，对照美国癌症联合委员会（AJCC）第八版癌症分期系统来判定。本研究经杭州市萧山区第一人民医院伦理委员会批准[伦审字（科）[2021]43号]，所有患者均已签署知情同意书。
1.1.2 TCGA队列数据：选取TCGA数据库（https∶//cancergenome.nih.gov）中的502例PTC患者临床及测序资料，其中男135 例，女367 例，根据lnc-CCDC33-1∶1相对表达量中位数分为低表达组（254例）和高表达组（248 例）。其中高表达组年龄为（46.2±15.7）岁，低表达组年龄为（48.4±15.9）岁。
1.2 实时定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）应用TRIzol（美国赛默飞世尔公司）提取组织标本中的RNA；
使用PrimeScript RT Master Mix（日本TaKaRa公司）试剂盒反转录生成cDNA；
应用SYBR Premix Ex Taq II（日本TaKaRa公司），于LightCycler 480 中进行扩增。扩增反应条件：95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，2-ΔΔCt法计算lnc-CCDC33-1∶1相对表达量。lnc-CCDC33-1∶1引物为：F 5’-AAGGCTCAGT GTGAGACCAG-3’，R 5’-GGACTAGGGAATGCTGTGACC-3’，GAPDH引物为：F 5’-GGCCAATCCTGAATCACACCT-3’，R 5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。
1.3 统计学处理方法 使用GraphPad Prism 6、SPSS22 及R 4.0 软件进行统计分析及绘图。计量资料以±s表示，2 组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例和率表示，2组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析lnc-CCDC33-1∶1对PTC的诊断价值。应用单因素Logistic回归分析lnc-CCDC33-1∶1表达量和相关临床特征（淋巴结转移、甲状腺外侵犯）之间的关系，其中性别和年龄作为协变量，lnc-CCDC33-1∶1作为自变量，相关临床特征作为因变量。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 lnc-CCDC33-1∶1在PTC组织中的表达 qRTPCR检测结果显示，与癌旁正常组织相比，lnc-CCDC33-1∶1在PTC组织中的表达量升高（P＜0.001），见图1。
图1 lnc-CCDC33-1∶1在PTC和癌旁正常甲状腺组织中的表达水平
2.2 lnc-CCDC33-1∶1对PTC的诊断价值 ROC曲线结果显示曲线下面积（area under the curve,AUC）为0.803（95%CI=0.736～0.869，P＜0.001），以相对表达量0.016作为截点值，Youden指数、敏感度和特异度分别为0.558、81.7%和74.2%，见图2。
图2 lnc-CCDC33-1∶1诊断PTC的ROC曲线
2.3 本地队列中lnc-CCDC33-1∶1与PTC临床病理因素的相关性 根据lnc-CCDC33-1∶1中位表达值，将本地队列中的PTC患者分为lnc-CCDC33-1∶1高表达组和低表达组，本地队列显示lnc-CCDC33-1∶1表达水平与PTC肿瘤大小（P=0.048）、腺外侵犯（P=0.011）、T分期（P=0.007）和淋巴结转移（P=0.003）相关，见表1。
表1 PTC中lnc-CCDC33-1∶1表达和临床病理的相关性（本地队列，每组n=60）
2.4 TCGA中lnc-CCDC33-1∶1与PTC临床病理因素的相关性 在TCGA数据队列中，根据其502例PTC样本的lnc-CCDC33-1∶1中位表达值，将TCGA组PTC患者分为lnc-CCDC33-1∶1高表达组和低表达组，TCGA组数据显示lnc-CCDC33-1∶1表达水平与PTC甲状腺外侵犯（P=0.028）、淋巴结转移（P＜0.001），见表2。
表2 PTC中lnc-CCDC33-1∶1表达和临床病理的相关性（TCGA）
2.5 Logistic回归分析lnc-CCDC33-1∶1与PTC淋巴结转移及甲状腺外侵犯的相关性 本地队列的单因素Logistic回归分析结果显示，lnc-CCDC33-1∶1高表达组淋巴结转移风险为lnc-CCDC33-1∶1低表达组的77.42倍（OR=77.42，95%CI=39.74～115.11，P＜0.001），而lnc-CCDC33-1表达高低不影响PTC甲状腺外侵犯的风险（P=0.143）。
PTC通常是一种预后良好、进展缓慢的肿瘤，一般通过手术或联合放射碘、促甲状腺激素（tyroidstimulating hormone,TSH）抑制等治疗均能达到很好控制。但是某些高危特征，如高龄、肿瘤大小≥3 cm、甲状腺外侵犯、淋巴结转移、远处转移和BRAF突变等与其不良预后相关[10]。尽管术前可通过超声或CT等影像学方式判断PTC外侵、淋巴结及远处转移等，但这些手段的预测价值有一定的局限性[3]。因此，利用新的分子标志物来早期预测或辅助鉴别PTC高危特征，可能对制定PTC的治疗方案和治疗后的临床转归有重要意义。
分子标志物已被广泛运用于多种疾病的辅助诊断和预后评估[11]。在甲状腺癌中，许多分子标志物，如BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8/PPARγ、galectin-3等，已被证实对术前性质不明确的甲状腺结节具有辅助诊断作用[12]。除mRNA和蛋白质等分子标志物外，还有许多microRNAs，如miR-146b、miR-221、miR-222、和miR-135b被发现与PTC腺外侵犯、进展期分期、BRAF突变等不良临床病理特征相关[13]。正如美国甲状腺协会指南所推荐的，当细胞穿刺也不能明确某些甲状腺结节的诊断时，可应用这些分子标志物协助诊断[3]。最近的研究显示lncRNA对肿瘤的发生发展起重要作用[14-16]。在PTC中有研究显示lncRNA发挥着一定作用，例如YOON等[5]发现lncRNA NAMA在BRAF突变的PTC中表达降低，并与肿瘤的生长阻滞相关；
JENDRZEJEWSKI等[7]发现SNP rs944289的患者更易发生PTC，其作用发挥与lncRNA PTCSC3相关。PTCSC3则具有抑癌作用，同时PTCSC3是miR-574-5p的竞争性内源性RNA，PTCSC3可能通过调控miR-574-5p的含量来进一步调节其靶基因而发挥作用[17]。因此，lncRNA也有望成为甲状腺癌的分子标志物。
本研究发现lnc-CCDC33-1∶1在PTC组织中表达升高，并经ROC曲线证实其具有较高的诊断价值。如果将lnc-CCDC33-1∶1与其他分子标志物联合应用于穿刺细胞学不能明确诊断的甲状腺结节的良恶性判断，可能有助于优化甲状腺结节的诊断与管理。同时本研究分析lnc-CCDC33-1∶1的表达量与PTC患者临床病理特征的关系，发现lnc-CCDC33-1∶1与PTC腺外侵犯、淋巴结转移等高危特征相关，为进一步的功能及机制研究建立了基础。另外，仅有的一项研究指出，lnc-CCDC33似乎和肿瘤特征性分类有关，例如在胰腺癌中，lnc-CCDC33是糖尿病胰腺癌的特征性基因。而lnc-CCDC33-1∶1作为lnc-CCDC33基因下游非编码区域的lncRNA，可能在甲状腺乳头状癌的进一步临床亚群分组中具有一定的意义[18]。近年来，非编码RNA（ncRNA）被揭示能编码转录小肽分子，代替ncRNA本体发挥肿瘤调节作用。例如在结肠癌中，lncRNA HOXB-AS3能够编码53个氨基酸的小肽，该小肽能够通过抑制PKM介导的葡萄糖代谢重编，从而抑制结肠癌细胞生长[19]。这说明，有可能存在lnc-CCDC33-1∶1编码小肽的可能，并借此调控甲状腺癌细胞增殖和转移。
然而，本研究尚存在一些不足。通过矫正年龄、性别、组织类型和BRAF V600E突变等因素后，发现lnc-CCDC33-1∶1的表达量与PTC的淋巴结转移风险和包膜外侵犯分风险无关。这意味着，在不同的年龄、性别、组织学类型和基因表达背景的亚组PTC人群中，lnc-CCDC33-1∶1对临床病理特征具有不同的影响。另外，研究发现本地队列数据和TCGA数据存在差异结果，即lnc-CCDC33-1∶1对肿瘤大小、肿瘤分期的影响存在差异性。上述的差异可能是不同队列的年龄构成比差异、种族差异、病例研究年限等因素所致。尽管如此，两组队列均指出lnc-CCDC33-1∶1高表达提高了甲状腺癌淋巴结转移风险和包膜侵犯风险。
综上所述，lnc-CCDC33-1∶1在PTC中表达异常升高，并与PTC高危特征相关。lnc-CCDC33-1∶1有望成为潜在的诊断标志物和治疗靶点。但是lnc-CCDC33-1∶1在不同人群中可能存在不同的临床意义，进一步揭示其在PTC中的具体作用需要扩大临床样本。与此同时，lnc-CCDC33-1∶1调节甲状腺侵袭性的分子机制也需要进一步探索。本研究为甲状腺癌乳头状癌的临床评估提供新的参考指标，同时为癌进展提供新的分子研究靶点。
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