岳锐，郑举敦，廖玉辉，杨斌
梅毒(syphilis)作为全球性公共卫生问题，长期位居我国法定乙类传染病发病率的第三位[1]。梅毒螺旋体(Treponemapallidum, TP)作为梅毒的病原体，属于密螺旋体属苍白密螺旋体中的苍白亚种，其结构由内向外依次为圆柱状原生质体、内鞭毛、胞质膜、肽聚糖层、周质空间、细胞外膜[2]。尽管其革兰氏染色呈阴性，但因不含脂多糖，故不是严格意义的革兰氏阴性菌。目前研究认为,TP致病过程主要涉及暴露、黏附/定植、侵袭/感染、播散等环节，现已有众多研究探索了TP致病过程中与不同宿主细胞相互作用的致病机制。本文将从不同过程，对TP及其相关蛋白在致病过程同各种宿主细胞相互作用的研究进展进行综述。
梅毒可通过性接触、胎盘等方式进行传播，其中性接触是最主要的传播途径。当梅毒患者皮肤黏膜部位含有TP，性接触过程中所产生的微擦伤会增加TP暴露感染风险，而这一过程中最先接触的是表皮中含量最多的角质形成细胞。
对此，Juanpere-Rodero等[3]发现在二期梅毒患者病理切片中，TP大量存在于表皮角质形成细胞之间。在59例梅毒切片中，有39例(66.1%)出现了坏死角质形成细胞，认为角质形成细胞坏死可能是二期梅毒的病理特征之一[4]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是作用于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的一类蛋白水解酶。Tsai等[5]发现，梅毒与HIV共感染患者脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中MMP-9、组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)-1、TIMP-2表达较正常患者明显升高，而TIMP-4表达下调，认为梅毒与HIV共感染患者CSF中MMP/ TIMP系统平衡失衡。在细胞层面，Jiang等[6]研究也发现，TP鞭毛蛋白(Flagellin B, FlaB)可通过Toll样受体5(Toll-like receptor 5, TLR5)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)/核转录因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)通路刺激人角质形成细胞系(HaCaT)产生MMP-9、MMP-13，从而有助于降解ECM成分，导致梅毒硬下疳溃疡的发生。
TP在既往研究中被发现为微需氧型菌，即仅在低浓度氧中生长，一方面它缺乏抵抗活性氧(reactive oxygen species, ROS)中间产物的保护机制，另一方面TP生物合成能力有限，其生存需要黏附、定植于宿主细胞，从宿主细胞中摄取营养成分，借助宿主细胞的过氧化氢酶等抵抗氧化物的毒性作用。TP的黏多糖酶有助于TP附着于黏多糖含量丰富的组织，如皮肤、脐带、主动脉、眼、胎盘等[7]。总之，目前认为黏附是TP致病机制中的关键初始步骤，黏附宿主细胞对于TP的持续生长和活力维持是必要的。
后续有众多学者通过扫描电子显微镜观察到TP可黏附多种宿主细胞，如人皮肤上皮细胞、血管内皮细胞、宫颈癌细胞系Hela、兔睾丸细胞、棉尾兔上皮细胞(Sf1Ep cottontail rabbit epithelial cells, Sf1Ep)、大鼠原代神经元细胞等。其中，Fitzgerald等[8]发现，TP所黏附的细胞表面形态、活力并未发生改变，由此提出TP与细胞的黏附可能是一种物理黏附。我国学者Wu等[9]发现，TP能够不均一地黏附于人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMEC)，且黏附数量随培养时间的延长而递增，在4 h黏附最多，然后黏附能力呈下降趋势，该黏附也不改变细胞形态的完整性，部分TP可能通过末端与细胞膜溶解的方式黏附于细胞表面。这是学者们对于TP黏附现象的初步观察。后续Lee等[10]发现，ECM成分纤连蛋白(fibro-nectin, FN)在介导TP黏附于宿主细胞中起到重要作用，且只有具备毒力的TP可通过结合人真皮微血管内皮细胞(human dermal microvascular endothelial cells, HDMEC)FN的RGD基序(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，从而偶联细胞整合素-α5β1而实现黏附，且该黏附可被抗-α5整合素抗体及合成的RGD肽段竞争性抑制。
TP0954是TP表面的脂蛋白，若在黏附缺陷的伯氏疏螺旋体B314菌株中表达此蛋白的基因，在硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素的介导下可促进该菌株黏附不同宿主细胞如上皮细胞、内皮细胞、神经元、人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞系及人胎盘组织切片等，这表明TP0954可能有助于TP定植皮肤上皮及远端播散性感染，特别是TP的跨胎盘传播[11]。此外，TP黏附素TP0751、TP0136用类似的基因操作方法也可与ECM成分(纤维蛋白原、FN、胶原Ⅰ、胶原Ⅳ、层粘连蛋白等)相互作用后黏附于宿主细胞表面[12-13]，这一操作方法为深入了解梅毒的发生发展及其免疫逃逸机制提供了技术支持。
另一方面，凭借TP容易黏附在Sf1Ep细胞的特点，目前TP体外培养主要采用在34 ℃、1.5%O2、5%CO2、93.5%N2环境下与Sf1Ep共培养的方式，但由于易污染、营养成分等问题仍不能实现TP在体外长久、稳定的增殖并保持其相当毒力，因此，TP的体外培养方法仍然需要进一步研究优化。
TP具有强大的侵袭、感染能力，导致梅毒发生发展过程中呈现不同的临床症状，可分为一期的硬下疳，二期的梅毒疹、扁平湿疣，三期的树胶肿、心血管、神经梅毒等。在病原体侵袭、感染过程中，多种宿主免疫细胞、炎症因子等发挥了重要的防御作用。
梅毒的基本病理改变为闭塞性动脉内膜炎及小血管周围炎，表现为内皮细胞肿胀、增生，管壁增厚、管腔狭窄，管周淋巴细胞、单核细胞(human myeloid leukemia mononuclear cells, THP-1)、浆细胞等浸润。Gao等[14]研究发现，TP可通过NF-κB通路刺激人真皮血管平滑肌细胞(human dermal vascular smooth muscle cells, HDVSMCs)在蛋白及mRNA水平增加白介素6(interleukin, IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)、细胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)的表达，从而促进人THP-1向HDVSMC的黏附、迁移，为解释TP所致的血管炎症反应提供新的见解。Zhang等[15]发现，TP0965可通过TLR2、MAPK通路(p-ERK、p-p38)诱导人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)趋化素(chemerin)及其受体23(chemerinreceptor 23, ChemR23) 表达，以自分泌/旁分泌的方式激活HUVEC；
并在Ras 同源基因家族成员A(ras homolog gene family member A, RhoA)/Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase, ROCK)通路的参与下诱导THP-1衍生的巨噬细胞向内皮细胞迁移。巨噬细胞被认为是早期杀灭TP的主力军。有研究[16-17]发现，TP可激活丝氨酸/苏氨酸激酶AKT-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)-NF-κB通路，刺激巨噬细胞由M0型向促炎M1型方向极化，促进炎症反应。此外，TP刺激M0巨噬细胞可诱导Nod 样受体家族包含 pyrin 结构域蛋白3(nod like receptor pyrin domain containing 3, NLRP3)炎症小体、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-1)的活化，促进IL-1β呈时间、剂量依赖性分泌[18]。以上这些结果均有助于阐释梅毒血管炎症的免疫发病机制。
P2X7受体(P2X7receptor, P2X7R)是ATP门控的三聚体离子通道，表达于大多数免疫、人体神经元细胞等。胞外的ATP可激活 P2X7R，诱导钾离子(K+)通道开放，引起K+外流，K+水平的降低可激活 NLRP3 炎症小体。Xu等[19]发现，TP可增加巨噬细胞P2X7R在mRNA、蛋白水平的表达，继而激活NLRP3，促进NLRP3依赖的IL-1β分泌增加及吞噬TP数量增多。此外，TP通过激活 NLRP3 炎症小体可触发巨噬细胞自噬以促进TP的被吞噬和清除[20]。Hawley等[21]发现，二期梅毒患者皮损的免疫组织化学显示TP存在于真表皮交界处、血管周围。在梅毒感染早期，巨噬细胞结合有限数量的未被抗体调理的TP，分泌少量炎症因子，造成TP的大量逃逸。随后，在抗原递呈细胞的作用下，淋巴细胞在局部分泌干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)等细胞因子，引发T细胞活化并协助B细胞成熟产生TP特异性抗体，这一过程也使得巨噬细胞表面FcγRs(主要为CD64)表达增加，促进巨噬细胞在人梅毒血清(human syphilitic serum, HSS)作用下对TP的调理吞噬作用。但吞噬效果仍旧有限且对于吞噬后的进一步发生发展过程还需进行深入探讨。
Marangoni等[22]从大鼠肝脏分离的库普弗(Kupffer)细胞与TP孵育20 min后即可检测到ROS，且35 min该值达到高峰。但细胞产生的ROS是否会对TP产生杀伤作用还需进一步深入探讨。
TP免疫逃逸的原因除了巨噬细胞的吞噬能力有限外，Babolin等[23]发现，二期梅毒患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中Treg细胞(CD4+CD25+high)较正常对照组表达增多。而TPF1可加剧这一反应并促进转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、IL-10 分泌，导致细胞免疫受到抑制，这可能是造成TP在宿主体内长期慢性感染的重要原因之一。
就神经元细胞而言，Oakes等[24]将TP与大鼠背根神经元细胞共孵育来探究细胞的电生理反应并发现暴露于2×108条/mL TP 的神经元细胞13 h后反应异常，18 h后没有反应，持续孵育会造成细胞不同程度的破坏。而暴露于热灭活TP或培养基的细胞在72 h后反应正常。这一发现将有助于阐释梅毒临床表现中的无痛性及TP对中枢神经系统(central nervous system, CNS)的损害。
另外，梅毒虽可产生硬下疳，但常可自愈。Luo等[25]发现，TP0136可通过TLR4诱导MCP-1/趋化因子受体2(chemokine C-C-motif receptor 2, CCR2)表达，促进成纤维细胞迁移，这可能为梅毒溃疡后期自我愈合的机制之一。
TP可通过血行、淋巴途径，穿过血脑、血睾、胎盘屏障等播散到全身各脏器。但目前研究多集中于血行播散，对淋巴播散机制研究较少。
Salazar等[26]研究发现，新西兰大白兔睾丸接种TP 24 h，即可在血液中检测到TP-FlaA的拷贝数。在细胞层面，Thomas等[27]提出，相较灭活的、无致病性的Reiter株，只有有毒力的TP才能穿透内皮细胞单细胞层。此外，透射电子显微镜捕捉到TP位于细胞间连接处，其可在不破坏紧密连接的情况下穿透内皮细胞层，离开血液循环系统而进入组织间隙。TP0965预处理HUVEC后使细胞渗透性增强，肌动蛋白F-actin的重塑增加，紧密连接蛋白Claudin-1的表达减少，表明TP0965可能通过改变细胞骨架蛋白结构及紧密连接蛋白的表达而调节HUVEC渗透性[28]。Lithgow等[29]通过免疫荧光、Transwell小室模型也发现TP定位于内皮细胞连接处，可在不破坏内皮细胞屏障渗透性的情况下破坏内皮细胞间钙粘连蛋白(vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin)，从而穿透内皮细胞屏障，但胆固醇依赖的脂筏介导的内吞抑制剂可抑制这一过程。因此推测，TP可能通过两种方式穿透内皮细胞屏障，一为“旁路”途径，即破坏细胞间连接蛋白进入，二为借助胆固醇依赖的脂筏介导的内吞作用穿透内皮细胞屏障。TP血管黏附素TP0751也可破坏VE-Cad-herin，但不能改变内皮细胞屏障渗透性，也不能穿透内皮细胞屏障。以上研究结果均有助于解释TP的血行播散机制。
也有文献报道TP外膜蛋白可促进血管生成，从而有利于TP播散。TPF1刺激HUVEC后可通过活化环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)/NF-κB通路，使IL-8而非血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)分泌增加，促进HUVEC增殖、迁移及微血管样结构形成[30]。同时，在斑马鱼卵黄囊注射TP47也同样具有促进血管生成的作用[31]。但尚未见TP本身促进血管生成的报道。
近年来，研究[32]发现多种病原体可活化血小板，且血小板本身对内皮细胞屏障通透性具有双向调控作用。Church等[33]利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)染色TP，用标记了PE/Cy5的血小板特异鼠抗人CD41单克隆抗体来指示血小板，应用流式、暗视野显微镜等方法研究TP与血小板的相互作用，发现TP以其尖端或边缘等方式活化血小板，并优先与活化的血小板相互作用，增加其旋转和平移速度，且这种相互作用是可逆的，这表明TP可能利用血小板功能来实现播散性感染。
梅毒致病机制涉及暴露、黏附/定植、侵袭/感染和播散过程，已在过去全世界科研工作者的不断努力下取得了许多进展，但TP及其相关蛋白在与不同宿主细胞相互作用过程中的毒力维持情况、繁殖特点、被吞噬后的降解过程、在体内的藏匿部位、淋巴播散方式等问题仍需进一步的深入研究。
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